靶向BnSVP的CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建

趙 恒，張 宏，廖芳麗，李 剛，趙福永

(1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.荊州市種子管理局，湖北 荊州 434020)

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9 system)是繼鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)系統(tǒng)后的一種新的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)基因敲除、基因插入與定點(diǎn)替換、染色體重組和多基因同步敲除等功能，且具有載體構(gòu)建簡(jiǎn)單，靶向特異性高等特點(diǎn)，是反向遺傳學(xué)中研究基因功能的一種重要工具[1]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在擬南芥[2-3]、煙草[4]、楊樹[5]等多種模式植物及水稻[6-7]、小麥[8-9]、玉米[10]等農(nóng)作物中成功應(yīng)用，在油菜中也已有報(bào)道。Yang等[11]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)以甘藍(lán)型油菜的4個(gè)基因家族(BnaRGA、BnaFUL、BnaDA1和BnaDA2)的12個(gè)基因成員作為靶標(biāo)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在T0，靶向單個(gè)基因的sgRNA引發(fā)的平均突變率為65.3%，而靶向多個(gè)同源基因的sgRNA組合其引發(fā)的突變率介于27.6%～96.6%，且純合突變易于發(fā)現(xiàn)，沒有發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象；在T1，突變基因按孟德爾遺傳規(guī)律遺傳，且不存在新突變和回復(fù)突變現(xiàn)象。Braatz等[12]以影響甘藍(lán)型油菜果瓣邊緣發(fā)育的2個(gè)ALCATRAZ(ALC)同源基因?yàn)榘袠?biāo)，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在T1篩選到1個(gè)alc雙等位純合突變株系，該株系能穩(wěn)定遺傳，在T2植株中未檢測(cè)到野生型ALC基因；全基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化載體序列在其基因組上存在至少5次獨(dú)立的插入事件，但沒有檢測(cè)到脫靶效應(yīng)。該突變株系是一個(gè)全新的甘藍(lán)型油菜抗裂莢種質(zhì)資源。

Shortvegetativephase(SVP)是擬南芥開花時(shí)間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，該基因的高表達(dá)會(huì)顯著延長植株的營養(yǎng)生長期[13]。甘藍(lán)型油菜SVP同源基因(BnSVP)具有9個(gè)外顯子，cDNA編碼區(qū)全長726 bp，翻譯產(chǎn)物具有典型的M、I、K和C結(jié)構(gòu)域，屬Ⅱ型MADS-box基因[14]。應(yīng)用TNDH群體，油菜開花時(shí)間調(diào)控機(jī)理研究團(tuán)隊(duì)在甘藍(lán)型油菜中鑒定了4個(gè)BnSVP同源基因，分別位于A4、A9、C4和C8連鎖群。為全面探討B(tài)nSVP的生物學(xué)功能，本研究采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建其基因組編輯載體擬對(duì)其進(jìn)行敲除突變，以觀測(cè)轉(zhuǎn)基因株系在開花時(shí)間等表型上的變異。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種與試劑

植物基因編輯載體pYLCRISPR-Cas9P35S-H(GenBank登錄號(hào)：KR029111)及CRISPR/sgRNA載體pYLsgRNA-AtU3b-LacZ(GenBank登錄號(hào)：KR029098)和pYLsgRNA-AtU3d(GenBank登錄號(hào)：KR029099)質(zhì)粒DNA由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉碩謙博士提供。大腸桿菌菌株TOP 10F′(LacIq)和F-DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上海維地生物技術(shù)公司；KOD plus酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；BsaⅠ-HF酶、T4DNA 連接酶和ATP購自New England Biolabs有限公司；限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和MluⅠ購自TaKaRa生物公司；DNA純化回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒、高純度dNTPs購自北京全式金生物技術(shù)公司。其他試劑均為分子試劑或分析純級(jí)別。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

載體構(gòu)建所需引物的設(shè)計(jì)參考唐雨薇等[15]進(jìn)行。靶向BnSVP特異位點(diǎn)的sgRNA種子序列的設(shè)計(jì)應(yīng)用CRISPR-P 2.0(http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)完成。設(shè)計(jì)流程為：首先選取U3作為sgRNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，sgRNA種子序列默認(rèn)長度為20 bp，靶標(biāo)基因組為Brassicanapus(4.1)，輸入BnSVP基因標(biāo)簽號(hào)BnaC08g34920D，點(diǎn)擊提交；然后再根據(jù)網(wǎng)站輸出結(jié)果及sgRNA設(shè)計(jì)的一般要求篩選特異性高、脫靶效應(yīng)低的DNA序列作為sgRNA種子序列。本試驗(yàn)所用引物序列(表1)均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、提取與菌種保存

取pYLCRISPR-Cas9P35S-H、pYLsgRNA-AtU3b-LacZ和pYLsgRNA-AtU3d質(zhì)粒DNA原液各1 μL，并用ddH2O稀釋10倍。采用熱激法分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TOP 10F′(LacIq)和F-DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布在含卡那霉素(50 mg/L)和氨芐青霉素(100 mg/L)的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落搖菌，用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取各載體質(zhì)粒DNA，用含20%滅菌甘油LB液體培養(yǎng)基保存各菌種。質(zhì)粒DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建

為提高打靶效率，每個(gè)靶向BnSVP的基因組編輯載體均同時(shí)包含2個(gè)靶點(diǎn)Targert 1(T1)和Target 2(T2)。sgRNA種子序列均選自BnSVP的外顯子區(qū)(或包含部分內(nèi)含子序列)，位于其編碼蛋白的重要功能域。

各靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建采用巢式(Nested)PCR和重疊(Overlapping)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，需要經(jīng)過2輪PCR反應(yīng)，第1輪2個(gè)PCR反應(yīng)，第2輪1個(gè)PCR反應(yīng)。T1sgRNA的構(gòu)建：第1輪反應(yīng)均以pYLsgRNA-AtU3b-LacZ(2～5 ng)為擴(kuò)增模板，第1個(gè)反應(yīng)用U-F/SVPAU3bT1引物組合，第2 個(gè)反應(yīng)用SVPAgRT1/gR-R引物組合，2個(gè)反應(yīng)使用相同的15 μL PCR擴(kuò)增體系[15]。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃，2 min；94 ℃，10 s，58 ℃，20 s，68 ℃，30 s，26個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢各取3 μL反應(yīng)液進(jìn)行電泳檢測(cè)，判斷擴(kuò)增片段的大小是否符合預(yù)期并估測(cè)其濃度。從上述2個(gè)反應(yīng)管中各取1 μL用ddH2O稀釋10倍，然后各取1 μL作為第2輪PCR擴(kuò)增的模板。第2輪PCR擴(kuò)增的引物組合為Pps-R-C/Pgs-GG2，擴(kuò)增體系為30 μL[15]。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃，2 min；94 ℃，10 s，58 ℃，20 s，68 ℃，30 s，28個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢，反應(yīng)液用2.0%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，切取含預(yù)期大小目標(biāo)片段凝膠用DNA純化回收試劑盒回收。T2sgRNA的構(gòu)建流程與T1sgRNA的構(gòu)建流程類似，但其擴(kuò)增質(zhì)粒模板為pYLsgRNA-AtU3d，第1輪2個(gè)反應(yīng)的引物組合分別為U-F/SVPAU3dT2和SVPAgRT2/gR-R；第2輪PCR反應(yīng)的引物組合為Pps-GG2/Pgs-L-C。

表1 靶向BnSVP基因組編輯載體構(gòu)建PCR引物Tab.1 PCR primers for genome editing constructs targeting BnSVP

注：序列中斜體小寫字母為酶切識(shí)別序列；大寫加粗字母為接頭序列。

Note：Sequence in italic lowercase letters represents restriction enzyme recognition site；Sequence in bold capital letters is linker.

1.5 雙靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9 載體的組裝

取T1sgRNA和T2sgRNA第2輪PCR回收產(chǎn)物各20 μL，pYLCRISPR-Cas9P35S-H質(zhì)粒溶液10 μL，BsaⅠ-HF 1.5 μL(30 U)，分別構(gòu)建50 μL酶切體系，37 ℃酶切30 min。酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，切取目的條帶用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，各取3 μL回收液進(jìn)行電泳并估測(cè)濃度。然后按照載體：靶標(biāo)分子數(shù)為1∶3的比例構(gòu)建10 μL連接反應(yīng)體系，16 ℃連接過夜。

1.6 重組載體的轉(zhuǎn)化與檢測(cè)

從-80 ℃冰箱中取1管(100 μL)F-DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰上化凍，取10 μL上述連接產(chǎn)物加入其中，輕彈混勻，冰浴靜置20 min；42 ℃水浴熱激45 s，迅速將管子置冰中2 min，加入平衡至室溫不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基700 μL；37 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)30 min；5 000 r/min離心1 min，留取100 μL上清并重懸浮菌塊，然后涂布于含25 mg/L Kan、200 mg/L IPTG和20 mg/mL X-gal 的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取藍(lán)斑菌落利用測(cè)序引物組合(SP-L2/SP-R-C)進(jìn)行菌落PCR。將陽性菌落接種于5 mL 含50 mg/L Kan 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取質(zhì)粒，SpeⅠ和MluⅠ雙酶切進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，挑取正確質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶向BnSVP的sgRNA設(shè)計(jì)

靶向特定基因或DNA片段的sgRNA由兩部分組成，即5′端的種子序列(約20 bp)和3′端保守的骨架序列(83 bp)，因此，載體構(gòu)建時(shí)僅需對(duì)20 bp的種子序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。用寧油7號(hào)SVP基因序列對(duì)甘藍(lán)型油菜參考基因組序列(v4.1)進(jìn)行同源搜索，共獲得4個(gè)BnSVP同源基因(BnaA09g42480D、BnaC08g34920D、BnaC04g35060D、LOC106446430)，與本團(tuán)隊(duì)前期利用TNDH群體對(duì)該基因的遺傳定位結(jié)果一致。應(yīng)用Lasergene 7.1對(duì)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，BnSVP.A09(BnaA09g42480D)與BnSVP.C08(BnaC08g34920D)cDNA的序列相似性為97.5%，氨基酸一致性為98.3%；BnSVP.A04(LOC106446430)與BnSVP.C04(BnaC04g35060D)cDNA的序列相似性為98.9%，氨基酸一致性為98.8%。而前二者和后二者之間的cDNA的序列相似性在90.8%～92.3%，氨基酸一致性在91.7%～92.5%，因此，4個(gè)BnSVP可以歸為2個(gè)亞組，推測(cè)各個(gè)亞組內(nèi)的基因成員在功能上更接近。因此，針對(duì)各亞組基因成員及全部4個(gè)BnSVP基因，應(yīng)用CRISPR-P 2.0(http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在線設(shè)計(jì)了12條sgRNA種子序列(表1、圖1)。

序列為BnSVP的cDNA編碼區(qū)及部分內(nèi)含子，大寫字母代表外顯子，符號(hào)*表示其邊界；小寫字母為內(nèi)含子序列；GG(+)/CC(-)表示PAM識(shí)別位點(diǎn)，下劃線標(biāo)記序列為靶向BnSVP的sgRNA的種子序列。Each sequence includes coding region and partial intron of BnSVP，Capital letters represent exonsand star symbols definite their borders, while lowercase letters represents intron sequences;GG(+)/CC(-)means the recognition PAM site of the Cas9,the sequence with underline means the candidate targeting sequence of BnSVP.

2.2 靶向BnSVP的sgRNA表達(dá)盒的擴(kuò)增

取pYLsgRNA-AtU3b-LacZ和pYLsgRNA-AtU3d質(zhì)粒DNA各1 μL，并用ddH2O稀釋100倍，分別用作T1sgRNA和T2sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建PCR擴(kuò)增模板。第1輪PCR引物組合U-F/SVPAU3bT1擴(kuò)增含LacZ-AtU3b片段，大小為580 bp，引物組合SVPAgRT1/gR-R擴(kuò)增T1sgRNA片段，大小為136 bp；引物組合U-F/SVPAU3dT2擴(kuò)增含AtU3d片段，大小為155 bp，引物組合SVPAgRT2/gR-R擴(kuò)增T2sgRNA片段，大小為135 bp(圖2-A)。第2輪PCR采用重疊PCR策略組裝各靶標(biāo)sgRNA，T1sgRNA擴(kuò)增產(chǎn)物長713 bp，T2sgRNA擴(kuò)增產(chǎn)物長289 bp(圖2-B)。

2.3 sgRNA表達(dá)盒與CRISPR/Cas9載體的組裝

sgRNA表達(dá)盒與CRISPR/Cas9載體的組裝采用Golden gate cloning策略[16]。在各靶標(biāo)sgRNA構(gòu)建的第2輪PCR所使用的引物中已設(shè)計(jì)有BsaⅠ-HF酶切識(shí)別序列(GGTCTC)和連接頭序列(表1)，CRISPR/Cas9載體和T1sgRNA及T2sgRNA DNA經(jīng)BsaⅠ-HF酶切后將會(huì)在各片段之間產(chǎn)生首尾兼容的4堿基5′突出末端(圖3)。sgRNA表達(dá)盒酶切片段與CRISPR/Cas9載體按正確順序連接的質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)化菌落在含Kan、IPTG和X-gal 的LB平板上會(huì)顯藍(lán)色。首先，挑取藍(lán)色單菌落用測(cè)序引物(SP-L2/SP-R-C)進(jìn)行菌落PCR，并同時(shí)進(jìn)行接種搖菌。正確組裝的質(zhì)粒載體其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 102 bp，而原質(zhì)粒載體的擴(kuò)增產(chǎn)物為825 bp(圖4-A)。選取菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小符合預(yù)期的菌液提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)一步用SpeⅠ和MluⅠ進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，正確組裝的基因組編輯載體能切出一條936 bp的片段，而原質(zhì)粒載體上無此兩限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(圖4-B)。綜合Kan篩選、藍(lán)白斑篩選、菌落PCR和雙酶切檢測(cè)結(jié)果，本研究所構(gòu)建的靶向BnSVP的6個(gè)基因組編輯載體均獲得了正確連接的質(zhì)粒DNA，測(cè)序結(jié)果如圖5所示。

A. 第1輪PCR擴(kuò)增；B. 第2輪PCR擴(kuò)增；M. 100 bp ladder DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；-. 陰性對(duì)照；1. AtU3d；2. T2sgRNA；3. LacZ-AtU3b；4. T1sgRNA；5. T2sgRNA 表達(dá)盒；6. T1sgRNA 表達(dá)盒。

A. 1st round PCR；B. 2nd round PCR；M. 100 bp ladder DNA Marker；-. Negative control；1. AtU3d；2. T2sgRNA；3. LacZ-AtU3b；4. T1sgRNA；5. T2sgRNA expression cassette；6. T1sgRNA expression cassette.

圖2sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果
Fig.2PCRfragmentsofsgRNAexpressioncassetteconstruction

圖3 sgRNA表達(dá)盒與CRISPR/Cas9載體組裝示意圖Fig.3 Diagram of dual sgRNA expression cassettes assembling with CRISPR/Cas9 vector

A.菌落PCR；B.雙酶切；M.100 bp ladder DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.pYLCRISPR-Cas9P35S-H質(zhì)粒；2～6.藍(lán)斑菌落；7.pYLCRISPR-Cas9P35S-H-SVPA-T1/T2質(zhì)粒；8. pYLCRISPR-Cas9P35S-H-SVPA-T3/T4質(zhì)粒；9.pYLCRISPR-Cas9P35S-H質(zhì)粒。

A. Colony PCR；B. Double digestion；M. 100 bp ladder DNA Marker；1. pYLCRISPR-Cas9P35S-H plasmid；2-6. Blue colonies；7. pYLCRISPR-Cas9P35S-H-SVPA-T1/T2 DNA；8. pYLCRISPR-Cas9P35S-H-SVPA-T3/T4 DNA；9. pYLCRISPR-Cas9P35S-H DNA.

圖4CRISPR/Cas9重組載體菌落PCR及雙酶切檢測(cè)
Fig.4ColonyPCRanddoubledigestiondetectionsofrecombinantCRISPR/Cas9vectors

3 討論

3.1 靶向多拷貝同源基因sgRNA的設(shè)計(jì)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種高效的植物基因組編輯工具。Cas9蛋白在sgRNA引導(dǎo)下能在特定位點(diǎn)切割DNA形成雙鏈斷口(Double-strand breaks，DSBs)，從而激活細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制，并通過同源重組(Homologous recombination，HR)或非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)造成特定位點(diǎn)堿基的插入或缺失，實(shí)現(xiàn)基因敲除。該系統(tǒng)的特異性主要決定于靶sgRNA中5′端約20 bp長的種子序列[17]。對(duì)于具有參考基因組序列的物種，sgRNA種子序列的設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單，尤其是靶向單拷貝基因的，但對(duì)多基因家族或多拷貝同源基因的特異sgRNA的設(shè)計(jì)則相對(duì)困難。

圖5 同時(shí)靶向4個(gè)BnSVP的CRISPR/Cas9重組載體測(cè)序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of recombinant CRISPR/Cas9-based vectors targeting four BnSVP homologues simultaneously

甘藍(lán)型油菜是異源四倍體(AACC，2n=38)，其基因組中多數(shù)基因同源拷貝數(shù)為4～6個(gè)，且其DNA序列相似度極高[18]。Yang等[11]研究表明，由于序列相似度達(dá)98.22%，無法設(shè)計(jì)特異的sgRNA用以區(qū)分BnaDA2家族的2個(gè)成員(BnaA2.DA2.1、BnaA2.DA2.2)。本研究在設(shè)計(jì)靶向4個(gè)BnSVP同源基因的特異sgRNA時(shí)，充分利用了其DNA正負(fù)鏈上的PAM位點(diǎn)，并應(yīng)用了雙靶點(diǎn)組合策略，能夠?qū)崿F(xiàn)4個(gè)或2個(gè)同源基因同時(shí)敲除，但其編輯效率還有待用原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)。

3.2 TsgRNA與CRISPR/Cas9載體的組裝

pYLCRISPR-Cas9P35S-H載體含有1個(gè)ccdB致死基因，而在ccdB表達(dá)盒兩側(cè)各有1個(gè)BsaⅠ酶切位點(diǎn)。經(jīng)BsaⅠ處理后，ccdB表達(dá)盒(685 bp)被切除，線性化載體的兩端分別形成了具有CGGT和CGAG的4堿基5′突出黏性末端[18]。T1sgRNA和T2sgRNA兩末端均設(shè)計(jì)有BsaⅠ酶切位點(diǎn)，經(jīng)BsaⅠ處理后，可形成與載體末端互補(bǔ)的4堿基黏性末端，在DNA連接酶的作用下可重新環(huán)化。本研究分別采用2種方法對(duì)雙靶點(diǎn)TsgRNA與CRISPR/Cas9載體的組裝效率進(jìn)行了比較分析，大腸桿菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果表明，酶切連接同體系的一步法比先酶切再連接的二步法的組裝效率略低，但2種方法均能獲得正確組裝的陽性克隆子。菌落PCR結(jié)果證明，抗性藍(lán)斑菌落并非全部是正確組裝的，而抗性白斑菌落也并非都是非正確組裝的，且白斑菌落中仍然存在含ccdB基因的非重組型質(zhì)粒，理論上含ccdB基因的質(zhì)粒和非LacIq基因型的宿主細(xì)胞是不兼容的。其主要原因可能與BsaⅠ的酶切錯(cuò)誤及之后的錯(cuò)誤連接有關(guān)[16]。此外，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行Kan篩選時(shí)，平板中Kan濃度不宜過高，本研究發(fā)現(xiàn)，以25 mg/L為最佳。若早期使用較高的Kan濃度則較難獲得轉(zhuǎn)化菌落，這可能與pYLCRISPR-Cas9P35S-H的低拷貝特性有關(guān)。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有簡(jiǎn)便高效的特點(diǎn)，是當(dāng)前植物基因組編輯技術(shù)的首選，已在植物功能基因組學(xué)研究和分子育種研究領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。隨著該系統(tǒng)的不斷完善和創(chuàng)新[19-20]，必將引領(lǐng)新一輪的植物分子生物學(xué)技術(shù)革命。

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