擬南芥Mo敏感突變體基因克隆及功能分析

杜亞琳，陳海燕，郝 寧，藤原徹，武 濤

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002；3.東京大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，東京 都文京區(qū) 113-8657)

鉬(Mo)是有機體內(nèi)重要的微量元素[1-3]。當(dāng)Mo濃度低于0.2 mg/kg時，植物會缺Mo，而Mo濃度高于6 mg/kg會產(chǎn)生毒性[4-5]。土壤pH值是影響鉬酸鹽生物利用度的重要因素之一，當(dāng)pH值低于5.5時，鉬酸鹽同化作用受到抑制[6]。為彌補鉬的缺乏，2種高效的方式是施鉬酸鹽肥和增加pH值。關(guān)于鉬酸鹽毒性的癥狀已經(jīng)有報道，如葉片顏色和色素變化以及生長減弱等[6-7]。目前，關(guān)于Mo作為有機嘌呤復(fù)合體的組成部分的生物學(xué)作用已被闡述[6，8-10]。然而，關(guān)于Mo毒性的研究報道卻很少。

當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時，植物的基因表達也會隨之發(fā)生改變[11-12]。目前，已經(jīng)鑒定出維持Mo平衡過程中的許多重要轉(zhuǎn)運蛋白，如MOT1和MOT2。鉬酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白MOT1已經(jīng)從擬南芥中鑒定出來，它參與Mo缺乏條件下的Mo吸收和轉(zhuǎn)運[13]。轉(zhuǎn)運蛋白MOT2定位于液泡上，并參與將儲存的鉬酸鹽從液泡輸出到細(xì)胞質(zhì)中，然后轉(zhuǎn)運到成熟的種子中的過程[14]。與硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族不同，另一個衣藻MOT2蛋白是促進因子超家族的主要成員[15]，表明鉬酸鹽在植物中存在不同并且復(fù)雜的代謝機制。

1 材料和方法

1.1 植物材料和生長條件

EMS誘變的Columbia(Col-0gl1-1)種子購自Lehle Seeds(目錄號M2E-01A-07(201B))。通過TAIR網(wǎng)站(www.arabidopsis.org)的ABRC中訂購AtRPI基因CS16363(rsw10-1)中的點突變純合品系的種子。F1種子來源于4-10和rsw10-1之間的雜交。將種子播種在MGRL生長培養(yǎng)基上[16]，然后將植株在22 ℃，16 h光照/8 h黑暗光周期的條件下培養(yǎng)。

1.2 突變體的鑒定和候選基因定位

在170 nmol/L Mo(1 Mo)MGRL培養(yǎng)基上共生長26 000個EMS誘變的M2種子。將短根的植株轉(zhuǎn)移到340 μmol/L Mo(2000 Mo)MGRL培養(yǎng)基中，并標(biāo)記根尖的位置。5 d后，將在2000 Mo條件下根伸長恢復(fù)的植株再次轉(zhuǎn)移到1 Mo培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，選擇其根伸長停止或緩慢的植物，并獲得M3種子。將M3種子播種到1 Mo和2000 Mo培養(yǎng)基上并確認(rèn)表型。第2次篩選后，獲得突變體4-10。

1.3 基因序列測定

使用RNeasy Plant Mini試劑盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)從葉片中提取總RNA。然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(PrimeScript RT試劑盒)，并用于基因克隆。回收PCR產(chǎn)物用于測序。引物序列見表1。

表1 基因克隆所需引物序列Tab.1 The primers for gene cloning

1.4 Mo含量測量

對1 Mo和2000 Mo條件下生長14 d的Col-0和4-10植株的根和地上部分分別進行取材，并用濃硝酸消化。然后將樣品溶解在0.08 mol/L HNO3中，并通過ICP-MS(SPQ9700；SⅡ，Chiba，Japan)進行Mo含量的測定。

1.5 根形態(tài)分析

植株在1 Mo和2000 Mo條件下，用體式顯微鏡(SZH10；Olympus)分析其根部形態(tài)。通過共聚焦熒光顯微鏡(FV-1000；Olympus)用PI(10 mg/mL；Molecular Probes)對生長14 d的幼苗根部進行根尖觀察，激發(fā)和發(fā)射波長分別為619，559 nm。每個株系超過10株植株進行分析。

1.6 尿苷敏感性測定

為了檢測4-10突變體和Col-0植株對尿苷的敏感性，將種子播種在含有1 Mo和5 mmol/L尿苷的組合培養(yǎng)基上。

1.7 根長測量

使用軟件ImageJ(http：//rsb.info.nih.gov/ij/)對生長10 d的植株根長進行測定，數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。每種條件下至少測量30株植株。

1.8 花青素測量

2 結(jié)果與分析

2.1 Mo敏感突變體4-10的鑒定

為了在正常的Mo條件下鑒定出新的突變體，本研究將EMS誘變的M2種子(共26 000個種子，Col-0 gl1-1)播種到170 nmol/L Mo(1 Mo)培養(yǎng)基上，選擇根伸長發(fā)育受到抑制的植株并轉(zhuǎn)移到340 μmol/L的Mo(2000 Mo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，將具有根長恢復(fù)的植株再次轉(zhuǎn)移到1 Mo培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，選擇根停止伸長或伸長發(fā)育緩慢的植株，單株收種得到M3種子。將M3種子播種到1 Mo和2000 Mo培養(yǎng)基上，選擇生長有差異的株系。經(jīng)過篩選后，獲得了一個編號為4-10的突變體(圖1-A)。根長測量結(jié)果表明，在1 Mo條件下，4-10和Col-0幼苗的根長分別為(1.56±0.13)cm和(11.89±0.71)cm；而在2000 Mo條件下，4-10和Col-0的根長分別為(3.3±0.17)cm和(6.8±0.73)cm(圖1-B)。

此外，4-10異常的根形態(tài)可以通過340 μmol/L的Mo處理后得到恢復(fù)(圖2)。而在1 Mo和2000 Mo條件下，4-10的地上部分表型與Col-0中觀察到的表型沒有區(qū)別，這與地上部分鮮質(zhì)量測定結(jié)果一致。

A.在不同Mo條件下生長的Col-0、4-10植株；B. Col-0和4-10植株的根長。不同字母表示基于Tukey測試的0.05水平上的顯著差異。圖3，5同。A. Col-0，4-10 seedlings grown in different Mo conditions；B. Root length of Col-0 and 4-10 seedlings. Different letters represent significant differences at the 0.05 level based on Tukey′s test.The same as Fig.3，5.

A～D. 過量Mo對Col-0和4-10植株初生根形態(tài)的影響；E～H. 過量Mo條件下Col-0和4-10根尖形態(tài)。A-D.Effects of excess Mo on primary root morphology of Col-0 and 4-10 plants；E-H.Effects of excess Mo on root tips of Col-0 and 4-10 seedlings.

A. Col-0和4-10植株在條件下表型；B. Col-0和4-10植株在條件下花青素相對含量。A. Col-0 and 4-10 seedlings grown under conditions；B. Relative anthocyanin contents of Col-0 and 4-10 plants grown under conditions.

2.2 Mo過量和敏感突變體4-10的基因克隆

A.4-10突變體候選基因精細(xì)定位；B.4-10突變體的測序區(qū)域；C.RPI中的點突變位置的示意圖；對植株生長的影響；E. 尿苷對植物生長的影響。A.Fine mapping of candidate genes of 4-10 mutant；B.Sequenced region of the 4-10 mutant；C.Schematic diagram of point mutation position in RPI；D.Effect of on plant growth；E.Effect of uridine on plant growth.

2.3 RPI的突變影響4-10植株體內(nèi)Mo動態(tài)平衡

植物具有感知內(nèi)部和外部Mo狀態(tài)的能力，然后通過基因表達的改變來適應(yīng)Mo條件的變化。為了確定4-10突變體的Mo敏感性是否發(fā)生了變化，測定了在1 Mo和2 000 Mo條件下4-10植株細(xì)胞中的Mo含量。結(jié)果表明，在1 Mo和2 000 Mo條件下，4-10突變體根中Mo含量顯著低于Col-0(圖5A)；在1 Mo條件下，4-10和Col-0植株根系Mo含量(以干質(zhì)量計)分別為(2.8±0.31)mg/kg和(4.2±0.28)mg/kg(圖5)；在2 000 Mo條件下，4-10和Col-0的根Mo含量分別為(1 000±112.92)mg/kg和(1 600±110.93)mg/kg(圖5)。在1 Mo條件下，Col-0和4-10突變體植株的地上部位中Mo含量沒有顯著差異(圖5-A)，在2 000 Mo條件下，4-10突變體地上部Mo含量顯著高于Col-0(圖5-B)。根中Mo含量的改變表明，RPI的突變參與了Mo的穩(wěn)態(tài)途徑而不是感應(yīng)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了證實這種假設(shè)，應(yīng)該通過測定Mo穩(wěn)態(tài)中涉及的幾個基因(如MOT1、MOT2等)的mRNA水平來對4-10突變體植株進一步分析。

圖5 4-10突變體植株根系Mo濃度低于Col-0Fig.5 Seedlings of 4-10 mutant had a lower root Mo concentration than that of Col-0

3 討論

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