大豆GmbHLH041基因的生物信息學(xué)分析及對鎘脅迫的響應(yīng)

劉曉慶，陳華濤，張紅梅，袁星星，崔曉艷，陳 新

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟作物研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良實驗室，江蘇 南京 210014)

重金屬污染已日益成為威脅人類健康的環(huán)境問題，而鎘(Cd)因其移動性大、毒性持久而成為毒性最強的重金屬元素之一[1]。長期暴露在鎘污染環(huán)境中會導(dǎo)致人體健康受損，包括肺氣腫、骨損傷(Itai-Itai)、癌癥、心血管疾病和不可逆轉(zhuǎn)的慢性腎功能衰竭[2-4]。

大豆因其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在世界上的消費越來越廣泛[5-6]。但有研究報道，大豆較易吸收重金屬[7]。最近的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一些基因家族參與調(diào)控植物對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運[8-9]，其中也包括了bHLH(Basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子家族[10]。

bHLH是普遍存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子家族，尤其是在哺乳動物中，其結(jié)構(gòu)、功能和進化都得到了很好的分析[11-12]。近年來，有關(guān)bHLH在植物中的功能報道越來越多，主要在植物表皮分化、響應(yīng)環(huán)境脅迫以及調(diào)控次生代謝調(diào)控中起著重要作用[13-15]。

前期對栽培大豆進行了Cd脅迫，并取其根系進行了轉(zhuǎn)錄組測序，對其差異基因進行分析發(fā)現(xiàn)，GmbHLH041基因在Cd脅迫后呈上調(diào)表達，推測該基因與大豆耐Cd性相關(guān)。本試驗結(jié)合NCBI(National Center for Biotechnology Information)和Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫，并通過生物信息學(xué)軟件，對大豆GmbHLH041基因進行進化樹分析和同源序列比對，并通過熒光定量PCR分析Cd脅迫下大豆根系中GmbHLH041基因的表達情況，為進一步明確大豆GmbHLH041基因的功能以及作物在Cd脅迫后的應(yīng)答機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 大豆GmbHLH041基因獲得及生物信息學(xué)分析

前期對Cd脅迫前后大豆根系進行了轉(zhuǎn)錄組測序，分析了差異基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過GmbHLH041基因(GenBank登錄號為 XM_006600391)在Cd脅迫后表達量急劇上升。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得GmbHLH041的序列，結(jié)合生物信息學(xué)分析軟件 BioXM 2.6對大豆GmbHLH041蛋白理化性質(zhì)進行分析。

大豆GmbHLH041蛋白進化樹分析：首先使用Clustal X2對氨基酸序列進行比對分析，然后用 MEGA 6 軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù) Bootstrap 重復(fù)1 000 次。

保守序列多重比對：首先使用Clustal X2對氨基酸序列進行比對分析，導(dǎo)出的文件格式通過GeneDoc軟件打開。

1.2 大豆幼苗培養(yǎng)和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

大豆種子用去離子水浸泡6 h，播種于營養(yǎng)土中，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。4 d后選取生長一致的幼苗移至1/2 Hoagland 營養(yǎng)液中培養(yǎng)，每2 d更換一次營養(yǎng)液。培養(yǎng)15 d后，用50 μmol/L CdSO4進行處理，取0，24 h的根系，液氮速凍于-80 ℃保存，用于目標(biāo)基因誘導(dǎo)表達分析。

1.3 總 RNA 提取和 cDNA 合成

將50 μmol/L CdSO4處理 0，24 h的根部組織用TRIzol 試劑進行提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 的濃度和純度。 采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)RNA合成cDNA。

1.4 基因表達分析

根據(jù)NCBI中GmbHLH041基因序列設(shè)計引物，引物序列為F：5′-GAACACTTCTTCCTCCA-3′；R：5′-ACAACTTTCTCCTCTCAC-3′；以大豆tublin基因作為內(nèi)參基因，tublin-F：5′-ATTCCCTTCCCTCGTCTG-3′；tublin-R：5′-CCTTGGTGCTCATCTTGC-3′，以cDNA為模板，按照 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)反應(yīng)體系進行定量 PCR 分析，以組成型表達的tublin為內(nèi)參，計算出目標(biāo)基因的相對表達量，每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmbHLH041的克隆與序列分析

以大豆根系cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴增出長度為1 629 bp的GmbHLH041的開放閱讀框(Opening reading frame，ORF)，編碼542個氨基酸的蛋白質(zhì)，GmbHLH041蛋白相對分子質(zhì)量為61.17 ku，理論等電點為5.89，在Phytozome數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，GmbHLH041基因位于大豆第17條染色體上。

用SOPMA對GmbHLH041蛋白氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該氨基酸序列主要以無規(guī)則卷曲(39.48%)、α-螺旋(37.27%)和伸展鏈(16.61%)為主，含少量的β-轉(zhuǎn)角(6.64%)(圖1)。利用TMHMM 2.0 Server對GmbHLH041蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有跨膜區(qū)段。

圖1 GmbHLH041蛋白氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 The secondary structure prediction of the GmbHLH041 amino acids sequence

GmbHLH041. 大豆，XP_006600454.1；GsbHLH041.野生大豆，KHN06623.1；CcbHLH041.木豆，XP_020221722.1；VrbHLH041. 綠豆， XP_014500514.1；VabHLH041. 小豆， XP_017421300.1；LabHLH041. 狹葉羽扇豆，XP_019462343.1；MtbHLH. 蒺藜苜蓿， XP_003595200.2；CabHLH041. 鷹嘴豆， XP_004488061.1；AibHLH041. 花生，XP_020974464.1；AdbHLH041.蔓花生， XP_015954671.1；JrbHLH041.胡桃， XP_018845545.1；MdbHLH041.蘋果， XP_008344123.1；SibHLH041. 芝麻， XP_011094007.1；AT5G56960.1 Ⅳd;AT1G68240.1Ⅴ1；AT3G59060.2Ⅶa；AT1G02340.1Ⅵb；AT4G30980.1X1；AT1G25330.1 Ⅻ;AT1G27740.1VⅢC；AT2G42280.1Ⅸ；AT3G47640.1Ⅴb；AT1G49770.1Ⅰb；AT1G69010.1 Ⅴa;AT3G21330.1Ⅷb；AT3G22100.1Ⅷa；AT3G19500.1Ⅹ；AT3G61950.1a；AT5G54680.1Ⅳc；AT2G22770.1Ⅳa；AT1G10610.1Ⅲc；AT4G21330.1Ⅲa；AT4G09820.1Ⅲf；AT5G65640.1Ⅲb；AT2G31210.1Ⅱ；AT1G32640.1Ⅲe；AT4G16430.1Ⅲd.擬南芥bHLH 12個亞家族中的24個bHLH蛋白。

GmbHLH041.(Glycinemax，XP_006600454.1)；GsbHLH041.(Glycinesoja，KHN06623.1)；CcbHLH041.(Cajanuscajan，XP_020221722.1)；VrbHLH041.(Vignaradiatavar.radiate， XP_014500514.1)；VabHLH041.(Vignaangularis， XP_017421300.1)；LabHLH041.(Lupinusangustifolius，XP_019462343.1)；MtbHLH.(Medicagotruncatula， XP_003595200.2)；CabHLH041.(Cicerarietinum， XP_004488061.1)；AibHLH041.(Arachisipaensis，XP_020974464.1)；AdbHLH041.(Arachisduranensis， XP_015954671.1)；JrbHLH041.(Juglansregia， XP_018845545.1)；MdbHLH041.(Malusdomestica， XP_008344123.1)；SibHLH041.(Sesamumindicum， XP_011094007.1)；AT5G56960.1 Ⅳd;AT1G68240.1Ⅴ1；AT3G59060.2Ⅶa；AT1G02340.1Ⅵb；AT4G30980.1Ⅹ1；AT1G25330.1 Ⅻ；AT1G27740.1ⅧC；AT2G42280.1Ⅸ；AT3G47640.1Vb；AT1G49770.1Ⅰb；AT1G69010.1 Ⅴa;AT3G21330.1Ⅷb；AT3G22100.1Ⅷa；AT3G19500.1Ⅹ；AT3G61950.1a；AT5G54680.1Ⅳc；AT2G22770.1Ⅳa；AT1G10610.1Ⅲc；AT4G21330.1Ⅲa；AT4G09820.1Ⅲf；AT5G65640.1Ⅲb；AT2G31210.1Ⅱ；AT1G32640.1Ⅲe；AT4G16430.1Ⅲd.24 Bhlh proteins from 12 bHLH subgroups ofArabidopsisthaliala.

圖2大豆GmbHLH041蛋白和其他物種bHLH蛋白的系統(tǒng)進化樹分析
Fig.2PhylogenetictreeanalysisofsoybeanGmbHLH041proteinandotherspeciesbHLHproteins

2.2 大豆GmbHLH041基因編碼蛋白系統(tǒng)進化樹及保守結(jié)構(gòu)序列分析

GmbHLH041蛋白在NCBI中進行比對，挑選親緣關(guān)系較近的12個其他物種的bHLH，并根據(jù)擬南芥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子亞家族的劃分[16]，在每個亞家族中選取至少 1個bHLH 氨基酸序列作為該亞家族的代表，從12個亞家族中共選取了24個 bHLH 蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進行進化樹分析，結(jié)果顯示，GmbHLH041與野生大豆(Glycinesoja)和狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)的bHLH041蛋白親緣關(guān)系較近，屬于擬南芥bHLH家族第4亞族Ⅳd中(圖2)。

多重比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GmbHLH041含有一個由60～70個氨基酸組成的保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括2個不同功能的保守區(qū)域：一個是位于N端參與DNA結(jié)合的由15個左右堿性氨基酸組成的區(qū)域(The basic region)，另一個是位于C端的HLH區(qū)域(The helix-loop-helix region)，主要參與形成二聚體，由2個疏水氨基酸形成的α-螺旋和1個可變環(huán)連接而成(圖3)。

圖3 大豆GmbHLH041蛋白保守序列多重比對Fig.3 Comparison of amino acid sequences of the bHLH domains of GmbHLH041

2.3 GmbHLH041基因qRT-PCR分析

分析了大豆根系在50 μmol/L CdSO4脅迫24 h后GmbHLH041基因的表達情況，從圖4可以看出，根系中GmbHLH041基因在Cd脅迫后表達量極顯著上升。

圖中不同字母代表差異顯著性(P<0.01)。Different letters in the figure represent significant difference(P<0.01).

3 討論

鎘是植物非必需營養(yǎng)元素，具有很強的生物毒性和較強的化學(xué)活性，在植物體內(nèi)大量積累，會通過食物鏈危及人類的健康[2-3，17]。植物在進化過程中會形成一系列機制以應(yīng)對環(huán)境脅迫[2]。

bHLH基因家族廣泛參與植物的生長發(fā)育[18-19]、應(yīng)對環(huán)境脅迫以及信號通路的調(diào)控[20-21]。目前，關(guān)于bHLH的研究主要集中在模式植物擬南芥中，近年來，陸續(xù)有研究報道，bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物對金屬離子的吸收。Van等[22]報道，Cd脅迫后，擬南芥以及Zn/Cd超富集植物天藍遏藍菜(Thlaspicaerulescens)中bHLH100轉(zhuǎn)錄因子的表達量上升，在擬南芥中過表達bHLH100能增加轉(zhuǎn)基因植株對Zn和Ni的耐受性。最新的研究發(fā)現(xiàn)，3個擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子(FIT、AtbHLH38和AtbHLH39)參與了植物對Cd脅迫的響應(yīng)[10]。

前期對Cd脅迫不同時間的大豆根系進行了轉(zhuǎn)錄組測序，對測序結(jié)果進行差異基因的篩選，發(fā)現(xiàn)GmbHLH041基因在Cd脅迫后表達量極顯著上升。通過PCR從大豆根系中克隆到該基因，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果顯示，該基因含有一個長度為1 629 bp的開放閱讀框(Opening reading frame，ORF)，編碼542個氨基酸的蛋白質(zhì)，GmbHLH041蛋白相對分子質(zhì)量為61.17 ku，理論等電點為5.89，位于大豆第17條染色體上。與擬南芥的系統(tǒng)進化樹分析顯示，GmbHLH041屬于第4亞族Ⅳd中，對4個bHLH同源基因氨基酸序列分析結(jié)果顯示，GmbHLH041含有一個典型的bHLH結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR結(jié)果表明，GmbHLH041基因在Cd脅迫后的大豆根系中上調(diào)表達，表明該基因可能與鎘脅迫調(diào)控有關(guān)。已經(jīng)進一步構(gòu)建了表達載體，以期獲得轉(zhuǎn)基因植株，進一步研究該基因的生物學(xué)功能。

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