半滑舌鰨繁育群體的遺傳組成及家系配組策略

李超 ，魯翠云 ，曹頂臣 ，鄭先虎 ，程磊 ，李慶華 ，薛志勇 ，孫效文

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.海陽市黃海水產(chǎn)有限公司，山東 海陽 265122）

半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis分布于黃、渤海地區(qū)的底層大型經(jīng)濟(jì)魚類，具有個(gè)體大、生長快、肉味鮮美等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛，逐漸成為我國海水養(yǎng)殖的重要種類。半滑舌鰨雌、雄個(gè)體生長速度相差懸殊，同齡個(gè)體雌性較雄性生長快30%～100%[1]，鑒定性別特異分子標(biāo)記[2-4]，利用雌核發(fā)育[5,6]、多倍體[7-9]等技術(shù)開展全雌性半滑舌鰨苗種培育成為研究熱點(diǎn)。但是，半滑舌鰨雌性異型性染色體（ZW）[10]的形式使其單性育種過程較雄性異型性染色體（XY）魚類更為復(fù)雜，無法獲得成活的“超雌”魚（WW），導(dǎo)致半滑舌鰨全雌魚的培育進(jìn)展緩慢[11,12]。

家系選育和群體選育是常用的魚類育種方法。陳松林等[13,14]通過家系間生長及抗病等性能的測試，獲得了生長速度快、抗病力強(qiáng)的家系。近幾年，魚類分子育種發(fā)展迅速，結(jié)合傳統(tǒng)育種方法開發(fā)出的基于親本遺傳背景的分子育種技術(shù)方案，在避免近親繁殖、優(yōu)化群體遺傳結(jié)構(gòu)、維持群體遺傳多樣性等方面效果顯著，已應(yīng)用于鏡鯉Cyprinus carpio var.specularis、大黃魚Larimichthys crocea等魚類的選育中[15-18]。黎中寶等[19]研究表明，半滑舌鰨的2個(gè)養(yǎng)殖群體的平均多態(tài)位點(diǎn)比例（37.85%）較2個(gè)野生群體（42.57%）降低了12.47%。面對日益萎縮的野生資源，在半滑舌鰨選育中注意保護(hù)群體基因庫的豐度對種質(zhì)的持續(xù)利用十分必要。近十年來，半滑舌鰨已完成共顯性標(biāo)記[20]、高密度圖譜及經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)QTL[21,22]等遺傳資源的儲(chǔ)備，具備了開展分子育種的基礎(chǔ)。本研究利用20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析半滑舌鰨親魚群體的遺傳組成，檢測雌雄親本間的遺傳距離分布，確定半滑舌鰨家系配組雌、雄遺傳距離的最佳“閾值”范圍，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果制定半滑舌鰨的配組策略。

1 材料與方法

1.1 材料

半滑舌鰨親魚樣品采自海陽市黃海水產(chǎn)有限公司。選擇體表健康無損傷、體色純正無白化、性腺發(fā)育較好的3齡后備親魚共291尾，其中雌魚98尾，平均體質(zhì)量（2 060±350）g，全長（64.18±4.94）cm，體高（19.84±1.83）cm；雄魚 193尾，平均體質(zhì)量（500±140）g，全長（42.08±4.77）cm，體高（11.78±1.48）cm。剪取部分鰭條組織用于提取基因組DNA[23]，同時(shí)采用只讀式電子芯片進(jìn)行個(gè)體標(biāo)識(shí)。

經(jīng)過分析獲得上述后備親魚的遺傳結(jié)構(gòu)，根據(jù)個(gè)體間的遺傳距離劃分繁殖譜系，以混合家系的生產(chǎn)方式獲得選育組，以公司常規(guī)生產(chǎn)的苗種作為對照，進(jìn)行室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖。經(jīng)10個(gè)月養(yǎng)殖，分別從群體選育組和對照組子代中隨機(jī)選取300尾個(gè)體，測量體質(zhì)量、體長等生長性狀。

1.2 標(biāo)記的選擇

依據(jù)半滑舌鰨高密度遺傳連鎖圖譜[21]均勻選擇并合成191個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，隨機(jī)選用6個(gè)樣本篩選標(biāo)記的擴(kuò)增條件及多態(tài)性，最終用于群體分析的20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分布于12個(gè)連鎖群，其引物序列見表1。

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測

用基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，Code No.DP304）從鰭條組織中提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)定量后稀釋成50ng/μL。建立15μL PCR反應(yīng)體系，含有終濃度10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、200μmol/L dNTP、0.5μmol/L引物，以及1U Taq DNA聚合酶和100ng DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性 30s，58℃復(fù)性 30s，72℃延伸 30s，27 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯帶。以DL1000（Takara Bio Inc.，Code No.3590A）作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用軟件Gel-ProAnalyzer（Version 4.5）分析電泳條帶的片段長度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件“魚類種質(zhì)資源遺傳分析裝置（ZL200710144749.3）”將基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為“0，1”格式，用軟件POPGENE（Version 1.32）計(jì)算各標(biāo)記等位基因頻率（allele frequency，P）、等位基因數(shù)（observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，Ne）、觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）和期望雜合度（expected heterozygosi-ty，He）。

表1 20個(gè)半滑舌鰨多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的引物信息Tab.1 Information of twenty microsatellite markers for half-smooth tongue sole C.semilaevis

用Bosteine等[24]的公式計(jì)算多態(tài)信息含量（polymorphisminformation content,PIC）：

式中，Pi、Pj分別為群體中第i個(gè)和第j個(gè)等位基因頻率，n為某一基因座上等位基因數(shù)。

使用軟件 PHYLIP（Version 3.695）的 GENDIST程序，計(jì)算雌、雄個(gè)體間的遺傳距離，使用軟件“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0”（登記號(hào)2011SR09-1052）繪制雌、雄個(gè)體聚類圖并劃分繁殖系譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記篩選及擴(kuò)增情況

隨機(jī)選取6個(gè)半滑舌鰨樣本確定191個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的最適退火溫度及多態(tài)性。結(jié)果共有180個(gè)標(biāo)記獲得清晰、穩(wěn)定的目的條帶，112個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性，多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的比例為62.20%。從中選擇20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記（表2）檢測全部樣本的基因型，片段大小在100～365bp之間，每個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出4～10個(gè)等位基因，共檢測到135個(gè)等位基因，多態(tài)信息含量在0.355～0.817之間，其中16個(gè)為高度多態(tài)標(biāo)記（PIC≥0.5）[24]，占 80%（圖1）。

2.2 雌、雄群體遺傳結(jié)構(gòu)

鑒于半滑舌鰨雌、雄親魚的生長性狀差異巨大，對雌、雄繁育群體的遺傳結(jié)構(gòu)分別統(tǒng)計(jì)（表2）。結(jié)果：20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在雌性群體的有效等位基因數(shù)（Ne）為 1.792～5.686，平均為 3.578；雄性群體為1.471～6.116，平均為3.508，雌性群體略大于雄性群體，但是，成對樣本T檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩者的差異不顯著（P=0.713＞0.05）。雌性群體的觀測雜合度（Ho）為0.418～0.835，平均為 0.606；雄性群體為 0.28～0.798，平均為0.548，雌性群體的觀測雜合度極顯著大于雄性群體（P=0.003＜0.01）。雌性群體的期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）較雄性群體高，但也沒有達(dá)到顯著水平（期望雜合度P=0.077；多態(tài)信息含量P=0.081）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：該半滑舌鰨雌性群體的多態(tài)性略大于雄性群體，親魚繁殖群體保持了高度的遺傳多樣性水平（PIC＞0.5）[24]，具備進(jìn)一步繁殖、篩選優(yōu)良品系的遺傳潛力。

在 20 個(gè)標(biāo)記中，cse22（174bp）、cse42（198bp）、cse71（195bp）、cse112（184bp）、cse179（171bp）和hncyse124（300bp）6個(gè)標(biāo)記的單個(gè)等位基因在雌、雄群體的等位基因頻率均超過了0.5（詳細(xì)數(shù)據(jù)未列出），提示人們在選育過程中要注意對稀有等位基因的保護(hù)，減少與性狀無關(guān)的少量等位基因的富集。

2.3 雌雄個(gè)體間遺傳距離及繁殖策略

依據(jù)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)計(jì)算表明，半滑舌鰨雌、雄親本個(gè)體間的遺傳距離在0.254～1.959之間，平均值為0.890，不同遺傳距離范圍的頻率呈正態(tài)分布，其中個(gè)體間遺傳距離在0.7～1.0之間的占51.82%（圖2），根據(jù)子代優(yōu)良性狀與親本間遺傳距離呈“n”形曲線的規(guī)律[25]，設(shè)定親本間遺傳距離閾值在0.7～1.0范圍之內(nèi)最佳。

圖1 部分半滑舌鰨親魚樣本在微衛(wèi)星標(biāo)記cse22、csou12和hncyse115的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR product of partial samples at cse22,csou12,and hncyse115 in half-smooth tongue sole C.semilaevis

表2 半滑舌鰨群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity index of microsatellite loci in half-smooth tongue sole C.semilaevis population

圖2 半滑舌鰨雌、雄個(gè)體間遺傳距離分布Fig.2 Profile of genetic distance between female and male in half-smooth tongue sole C.semilaevis population

用“基于親本遺傳背景的分子育種軟件1.0”采用家系配組和群體配組相結(jié)合的方式劃分繁殖系譜，最終確定半滑舌鰨的繁殖策略為：選擇位于不同繁殖系譜、遺傳距離在0.7～1.0之間，且表型性狀在均值以上的一對或多對親本生產(chǎn)單家系或混合家系。

根據(jù)此策略獲得的混合家系選育組，對體質(zhì)量、體長等生長性狀的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在相同養(yǎng)殖條件下，經(jīng)本策略獲得的混合家系選育組半滑舌鰨的平均體質(zhì)量、體長與對照組差異顯著，其中平均體質(zhì)量高于對照組24.56%，平均體長高于對照組6.98%（表3）。

表3 半滑舌鰨親本經(jīng)選育的子代和對照組子代的生長性狀Tab.3 Growth of F1in selective population and control population in half-smooth tongue sole C.semilaevis

3 討論

自21世紀(jì)初半滑舌鰨的人工繁殖及工廠化育苗技術(shù)逐漸成功以來，由于價(jià)值高、利潤大，苗種繁育和成魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛。維持繁殖群體內(nèi)的遺傳多樣性水平是群體持續(xù)利用的前提和保障。本研究采集的半滑舌鰨繁殖群體樣本較大，雌性的有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量4項(xiàng)遺傳參數(shù)分別為 3.578、0.606、0.696和0.654；雄性分別為 3.508、0.548、0.655 和 0.616，表明半滑舌鰨育種群體處于高度的多態(tài)水平，具備進(jìn)一步開展品種選育和生產(chǎn)的潛力。但是，遺傳參數(shù)較 2011 年徐營等[26]的研究結(jié)果（3.935、0.7135、0.7303和0.6804）已有所降低。多項(xiàng)研究也表明，養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較野生群體有顯著降低[19,27]。因此，在野生資源日益萎縮，無法及時(shí)補(bǔ)充現(xiàn)有養(yǎng)殖群體的遺傳多度的情況下，在育苗過程中保護(hù)現(xiàn)有遺傳資源非常必要。

在獲得經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)，多代近交帶來的性狀衰退也非常嚴(yán)重。以半滑舌鰨白化病為例，在母本均為養(yǎng)殖群體的情況下，父本為養(yǎng)殖群體的家系的平均白化率（19.38%）遠(yuǎn)高于父本為野生群體的（3.21%）[28]?；谟H本遺傳背景的分子育種技術(shù)能夠最大限度地避免近親交配[15]，其中最核心的技術(shù)要點(diǎn)就是要首先確定最佳雌、雄親本間配組的遺傳距離“閾值”。本研究利用20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了半滑舌鰨雌、雄個(gè)體間的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)其分布呈正態(tài)性，與家系生長性狀和親本間遺傳距離的相關(guān)性趨勢相似。魯翠云等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著鏡鯉親本間遺傳距離的增加，家系的生長性狀呈先升高后下降的趨勢，配組的最佳遺傳距離范圍在0.5～0.7之間。畢金貞等[29]對牙鲆Paralichthys olivaceus的研究中得到了相似的結(jié)果，隨著遺傳距離的增大，遺傳距離與性狀的關(guān)系呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（D=0.2578～0.5958）、無顯著相關(guān)性（D=0.6099～0.6604）到顯著負(fù)相關(guān)（D=0.6640～0.9773）的變化。因此，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和本研究結(jié)果，確定指導(dǎo)半滑舌鰨家系配組的親本間遺傳距離范圍為0.7～1.0之間。

半滑舌鰨作為近十幾年新興的海水養(yǎng)殖魚類，親魚多為經(jīng)過人工馴化的野生種或選育時(shí)間短的累代養(yǎng)殖種，在選育過程中制定正確的選育方式，避免近親繁殖，保護(hù)群體遺傳多樣性對種質(zhì)資源的持續(xù)利用及養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展十分必要。本研究借鑒其他魚類的分子育種經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合研究結(jié)果和生產(chǎn)實(shí)際，制定出半滑舌鰨分子育種的策略為：選擇位于不同繁殖系譜，遺傳距離在0.7～1.0之間，且表型性狀在均值以上的一對或多對親本生產(chǎn)單家系、混合家系或群體繁殖，將群體內(nèi)或家系內(nèi)的近交系數(shù)降至最低，以最大限度地避免由近親繁殖造成的優(yōu)良性狀衰退，并在此基礎(chǔ)上生產(chǎn)、篩選性狀優(yōu)良的基礎(chǔ)群體。

［1］李靜,陳松林,溫海深.魚類性別相關(guān)基因及性別特異標(biāo)記的研究進(jìn)展［J］.海洋水產(chǎn)研究,2006,27（4）:90-95.

［2］Chen S L,Li J,Deng S P,et al.Isolation of female-specific AFLP markers and molecular identification ofgenetic sexin half-smooth tongue sole （Cynoglossus semilaevis）［J］.Marine Biotechnology,2007,9（2）:273-280.

［3］馬洪雨,陳松林,李靜,等.半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記CseF783的克隆及其在遺傳性別鑒定中的應(yīng)用［J］.遺傳,2009,31（1）:88-94.

［4］Liao X L,Xu G B and Chen S L.Molecular method for sex identification of half-smooth tongue sole（Cynoglossus semilaevis）using a novel sex-linked microsatellite marker［J］.International Journal of Molecular Sciences,2014,15（7）:12952-12958.

［5］Chen S L,Tian Y S,Yang J F,et al.Artificial gynogenesis andsexdeterminationinhalf-smoothtonguesole（Cynoglossus semilaevis）［J］.Marine Biotechnology,2009,11（2）:243-251.

［6］ Ji X S,Tian Y S,Yang J F,et al.Artificial gynogenesis in Cynoglossus semilaevis with homologous sperm and its verificationusingmicrosattlitemarkers［J］.AquacultureResearch,2010,41（6）:913-920.

［7］陳松林,李文龍,季相山,等.半滑舌鰨三倍體魚苗的人工誘導(dǎo)與鑒定［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2011,35（6）:925-931.

［8］李文龍,陳松林,季相山,等.半滑舌鰨四倍體魚苗的誘導(dǎo)與鑒定［J］.中國水產(chǎn)科學(xué),2012,19（2）:196-201.

［9］劉志鵬,王旭波,翟介明,等.半滑舌鰨三倍體誘導(dǎo)研究［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,42（6）:77-80.

［10］周麗青,楊愛國,柳學(xué)周,等.半滑舌鰨染色體核型分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2005,29（3）:417-419.

［11］Chen SL,ZhangGJ,ShaoC W,et al.Whole-genome sequence ofa flatfish provides insights into ZW sex chromosome evolution and adaptation to a benthic lifestyle［J］.Nature Genetics,2014,46（3）:253-260.

［12］張全啟,王旭波,王志剛,等.牙鲆和半滑舌鰨性別控制育種研究進(jìn)展［C］.“全球變化下的海洋與湖沼生態(tài)安全”學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集,2014.

［13］陳松林,杜民,楊景峰,等.半滑舌鰨家系建立及其生長和抗病性能測定［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2010,34（12）:1789-1794.

［14］陳松林,李仰真,張靜,等.半滑舌鰨快速生長及高雌性家系的篩選［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2013,37（4）:481-488.

［15］孫效文,魯翠云,賈智英,等.水產(chǎn)動(dòng)物分子育種研究進(jìn)展［J］.中國水產(chǎn)科學(xué),2009,16（6）:981-990.

［16］魯翠云,曹頂臣,孫效文,等.微衛(wèi)星分子標(biāo)記輔助鏡鯉家系構(gòu)建［J］.中國水產(chǎn)科學(xué),2008,15（6）:893-901.

［17］魯翠云,金萬昆,李超,等.微衛(wèi)星分子標(biāo)記指導(dǎo)鏡鯉群體選育［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志,2011,24（3）:29-34.

［18］常玉梅.鯉魚、中華絨螯蟹和大黃魚微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用研究［D］.廣州:中山大學(xué),2008.

［19］黎中寶,雷光高,常建波,等.半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）野生與養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性的比較研究［J］.海洋與湖沼,2011,42（3）:414-418.

［20］Wang X,Zhang Q,Sun X,et al.Isolation and characterization of 64 novel microsatellite markers from a fosmid library of female half-smooth tongue sole（Cynoglossus semilaevis）［J］.Molecular Ecology Resource,2008,8（6）:1303-1306.

［21］Song W,Li Y,Zhao Y,et al.Construction of a high-density microsatellite genetic linkage map and mapping of sexual and growth-related traits in half-smooth tongue sole （Cynoglossus semilaevis）［J］.PloS One,2012,7（12）:e52097.

［22］張俊杰,張文婷,高峰濤,等.半滑舌鰨3D-BAC池構(gòu)建及性別連鎖標(biāo)記的物理定位［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015,23（2）:141-150.

［23］李超,魯翠云,鄭先虎,等.一種保存魚類鰭條的便捷方法［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志,2014,27（1）:22-24.

［24］Botstein D,White R L,Skolnick M,et al.Construction ofa genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms ［J］.American Journal of Human Genetics,1980,32（3）:314-331.

［25］孫效文.魚類分子育種學(xué)［M］.北京:海洋出版社,2010.

［26］徐營,邵長偉,鄧寒,等.半滑舌鰨養(yǎng)殖群體和減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳多樣性分析［J］.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,2011,32（4）:14-19.

［27］馬騫,林琳,柳淑芳,等.半滑舌鰨生長相關(guān)基因的微衛(wèi)星及其在種群遺傳結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用［J］.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,2012,33（4）:18-25.

［28］李仰真,陳松林,邢賀飛,等.半滑舌鰨白化現(xiàn)象的初步研究［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2014,38（1）:76-83.

［29］畢金貞,陳松林.牙鲆親本間遺傳距離與其后代生長速度的相關(guān)性分析［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26（15）:395-401.