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    大豆渣制備細(xì)菌纖維素的研究1

    2018-07-05 01:57:06鄒小周
    纖維素科學(xué)與技術(shù) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:解液豆渣碳源

    高 媛 , 鄒小周 , 洪 楓 , 陳 琳 *

    (1. 纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東華大學(xué)),上海 201620;2. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620)

    細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose, BC)是由微生物產(chǎn)生的超細(xì)納米纖維結(jié)構(gòu)纖維素,因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)可被廣泛應(yīng)用于造紙、食品、功能材料等領(lǐng)域[1]。作為一種高附加值的生物材料[2],BC還在人造血管[3]、藥物緩釋[4]、傷口敷料[5]等諸多領(lǐng)域受到研究者的關(guān)注[6]。但BC高成本和低產(chǎn)量限制了其工業(yè)化生產(chǎn),特別是較高的培養(yǎng)基碳源成本已成為BC工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的主要障礙。近年來(lái),已有報(bào)道利用工農(nóng)業(yè)原料和廢棄物制備BC的各種嘗試,如利用魔芋[7]、麥稈[8]、稻稈[9-10]、甘蔗糖蜜[11]、紙漿廢料[12]、腰果樹(shù)殘?jiān)黐13]、廢棄棉織物[14]和云杉水解液[15]等。

    大豆渣是大豆加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物,但由于豆渣所含熱能低且口感粗糙,一直以來(lái)未引起人們的重視。豆渣過(guò)去大多作為家畜飼料或廢棄物傾倒,造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[16]。目前豆渣主要的利用方式包括:發(fā)酵制醬油[17]、食品添加劑、提取膳食纖維、提取水解蛋白等[18-19]。豆渣干物質(zhì)中一般含有60~70%的糖類[20-21],這些糖類可降解成葡萄糖等可發(fā)酵糖。利用這些糖發(fā)酵制備BC,不僅可以降低BC生產(chǎn)成本,還可以解決廢棄豆渣造成的環(huán)境污染等問(wèn)題。

    本文以提取了豆油和蛋白的大豆渣為原料,經(jīng)酸預(yù)水解后再進(jìn)行酶水解,并以預(yù)水解液和酶水解液為碳源分別制備BC,比較兩者在BC產(chǎn)量上的差異,擬開(kāi)發(fā)一種新的低成本培養(yǎng)基碳源。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 菌體和原料

    所用菌種:木葡糖酸醋桿菌DHU-WYZ-1,實(shí)驗(yàn)室篩選菌種;大豆渣由南通來(lái)寶谷物蛋白公司提供,是經(jīng)榨油和提取蛋白后的纖維渣;纖維素酶購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

    1.2 工藝流程

    1.3 還原糖得率的測(cè)定

    還原糖濃度的測(cè)定通過(guò)3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[22]。還原糖得率通過(guò)公式(1)計(jì)算得到。

    1.4 纖維素酶活測(cè)定

    采用濾紙酶活檢測(cè)法測(cè)定所使用纖維素酶的酶活[23]。濾紙酶活(filter paper activity,F(xiàn)PA)的定義:在50℃、pH4.8的條件下,每分鐘由濾紙底物生成2.0 mg葡萄糖所需的酶用量為一個(gè)FPU。

    1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

    1.5.1 酸預(yù)處理單因素實(shí)驗(yàn)

    研究酸濃度、底物濃度、溫度和時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響。1)在底物濃度45 g/L、120℃和反應(yīng)時(shí)間30 min條件下,研究酸濃度在1%~11%范圍內(nèi)對(duì)還原糖得率影響。2)固定其他條件,酸濃度為5%,研究底物濃度在30~90 g/L范圍內(nèi)對(duì)還原糖得率影響。3)固定其他條件,設(shè)定反應(yīng)溫度范圍為105~120℃(反應(yīng)器限制,溫度最高只能到129℃),研究溫度對(duì)還原糖得率影響。4)固定其他條件,反應(yīng)時(shí)間15~90 min,研究時(shí)間對(duì)還原糖得率影響。

    1.5.2 酶水解單因素實(shí)驗(yàn)

    研究酶濃度、底物濃度、溫度和時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響。1)在底物濃度30 g/L、pH為4.8、50℃條件下,加入纖維素酶130~325 U/mL,恒溫水浴振蕩(100 r/min)8 h,研究酶濃度對(duì)還原糖得率的影響。2)固定其他條件,酶濃度為325 U/mL,研究底物濃度在40~150 g/L范圍內(nèi)對(duì)還原糖得率的影響。3)固定其他條件,設(shè)置溫度為35~60℃,研究溫度對(duì)還原糖得率的影響。4)固定其他條件,反應(yīng)6~30 h,研究時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響

    1.6 培養(yǎng)基的制備

    1.6.1 稀酸預(yù)處理豆渣

    底物濃度為60 g/L,酸濃度為5%(w/V),120℃反應(yīng)30 min,冷卻過(guò)濾,濾液保存用于制備BC,濾渣用去離子水洗至pH≥4.5并用凍干機(jī)凍干36 h,得到酶解底物濾渣。

    1.6.2 纖維素酶水解濾渣

    準(zhǔn)確稱取1.1 g已凍干的濾渣于50 mL容器中,加入19 mL去離子水,調(diào)節(jié)pH為4.8,加入纖維素酶液至反應(yīng)液中纖維素酶的終濃度為325 U/mL,50℃水浴震蕩反應(yīng)24 h,冷卻過(guò)濾,濾液保存用于制備BC。

    1.6.3 酸預(yù)水解液和酶水解液的脫毒及培養(yǎng)基制備

    1)活性炭脫毒:向水解液中加入2%(w/V)的活性炭,在室溫下劇烈攪拌反應(yīng)5 min后,在9 500 r/min的條件下離心10 min,取出后再進(jìn)行傾濾,取出上清液用10 M的NaOH溶液調(diào)pH至5.0。2)Ca(OH)2脫毒:加入Ca(OH)2調(diào)節(jié)水解液的pH至11.0,在30℃下反應(yīng)3 h,在9 500 r/min的條件下離心10 min,取出上清液后用10 M的H2SO4溶液調(diào)pH至5.0[24]。將不同方式處理后的酸預(yù)水解液和酶水解液測(cè)還原糖濃度,按還原糖添加量為25 g/L配制培養(yǎng)基,并以25 g/L葡萄糖為對(duì)照組,分別加入5 g/L胰蛋白胨和3 g/L酵母粉于121℃,20 min條件下滅菌得木醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基(如表1所示)。

    1.6.4 基本培養(yǎng)基

    葡萄糖25 g/L,胰蛋白胨5 g/L,酵母粉3 g/L,pH為5.0,121℃滅菌20 min。

    表1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組及所對(duì)應(yīng)的編號(hào)

    1.7 菌種培養(yǎng)及細(xì)菌纖維素的制備

    從菌種斜面上取一環(huán)木醋桿菌接入含基本培養(yǎng)基的錐形瓶中,在30℃,160 r/min的搖床中培養(yǎng)種子液。將培養(yǎng)1 d的種子液以10%(V/V)的接種量接入50 mL錐形瓶中,錐形瓶?jī)?nèi)裝有各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基15 mL。接種后,將錐形瓶置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 d,在液體培養(yǎng)基表面生成細(xì)菌纖維素膜。

    1.8 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的測(cè)定

    取出培養(yǎng)好的細(xì)菌纖維素膜,經(jīng)蒸餾水多次沖洗后浸入 1%(w/V)的 NaOH溶液中,80℃水浴處理2 h,除去殘存的菌體和培養(yǎng)基,取出后清洗,然后再浸入80℃去離子水中清洗2 h,反復(fù)多次,直至細(xì)菌纖維素膜呈白色半透明狀,再用去離子水反復(fù)沖洗至中性,經(jīng)冷凍干燥36 h后稱重。計(jì)算公式(2)如下。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 酸預(yù)處理和酶水解單因素實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 酸或酶等催化劑濃度對(duì)還原糖得率的影響

    酸水解反應(yīng)(圖1a)中,還原糖得率隨酸濃度的增加先上升,后趨于平緩。因?yàn)楫?dāng)溫度一定時(shí),增加酸濃度能促進(jìn)半纖維素和少量纖維素降解生成單糖,繼續(xù)增加酸濃度會(huì)使單糖降解成糠醛和羥甲基糠醛等化合物,造成還原糖得率上升緩慢,所以酸濃取5%較合適。在酶水解反應(yīng)(圖1b)中,當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí),還原糖得率隨酶濃度的增加先上升,后趨于平緩。說(shuō)明當(dāng)酶濃度達(dá)到一定程度以后,底物與酶的結(jié)合呈飽和狀態(tài),過(guò)多的酶會(huì)造成不必要的浪費(fèi),纖維素酶濃度取325 U/mL較合適。

    圖1 催化劑濃度對(duì)還原糖得率的影響

    圖2 底物濃度對(duì)還原糖得率的影響

    2.1.2 底物濃度對(duì)還原糖得率的影響

    酸水解反應(yīng)(圖2a)中,隨著底物濃度的增加,還原糖得率變化不大,而還原糖濃度呈遞增趨勢(shì)。在實(shí)際操作過(guò)程中,底物濃度超過(guò)70 g/L,難以攪拌均勻,體系流動(dòng)性差,底物濃度超過(guò)90 g/L,稀酸溶液不能完全浸濕底物,反應(yīng)物接觸不充分。綜合考慮,底物濃度為60 g/L較合適。在酶水解反應(yīng)(圖2b)中,還原糖得率隨底物濃度的增大逐漸減小,而還原糖濃度先增加后減小。在底物濃度為115 g/L時(shí),糖濃達(dá)最大值。因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí),相對(duì)液量較少,酶解過(guò)程中糖的擴(kuò)散和酶的轉(zhuǎn)移都受到限制,體系不均、流動(dòng)性差,酶解速率降低,還原糖得率降低。綜合考慮,底物濃度選55 g/L較合適。

    2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)還原糖得率的影響

    酸水解反應(yīng)(圖3a)中,在所取溫度范圍內(nèi),還原糖得率逐漸上升,且120℃時(shí)還原糖得率最高。在酶水解反應(yīng)(圖 3b)中,還原糖得率隨溫度的升高,先上升后下降,在 50℃時(shí),達(dá)最大值。這與纖維素酶的最適反應(yīng)溫度有關(guān),隨著溫度升高酶催化反應(yīng)速率加快,但超過(guò)最適反應(yīng)溫度后,繼續(xù)升高溫度會(huì)使酶活性降低甚至失活,導(dǎo)致酶解反應(yīng)速率下降,還原糖得率下降。

    圖3 反應(yīng)溫度對(duì)還原糖得率的影響

    圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響

    2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響

    酸水解反應(yīng)(圖4a)中,時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響并不明顯,此條件下,反應(yīng)30 min時(shí)還原糖得率最大。在酶水解反應(yīng)(圖4b)中,還原糖得率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),先上升后趨于平緩,可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),酶解液中的葡萄糖含量和纖維素二糖含量逐漸增加,對(duì)酶水解反應(yīng)起到了一定的抑制作用。

    根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),綜合考慮酸預(yù)處理的適宜條件為:酸濃度為5%,底物濃度為60 g/L,溫度為120℃,時(shí)間為30 min。此條件下,還原糖得率為51.7%。酶水解的適宜條件為:纖維素酶濃度325 U/mL,底物濃度55 g/L,溫度50℃,pH為4.8,時(shí)間24 h。此條件下,還原糖得率為54.5%。

    2.2 細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量及分析

    2.2.1 發(fā)酵過(guò)程中還原糖濃度的變化

    由圖5a可知,以酸預(yù)處理液作為碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組在0~6 d內(nèi)木醋桿菌生長(zhǎng)較快,第6 d開(kāi)始還原糖濃度因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而回升。Ca(OH)2脫毒組在0~12 d內(nèi)還原糖一直在消耗?;钚蕴棵摱窘M在3~9 d內(nèi)耗糖較快。未處理組中木醋桿菌從第6 d開(kāi)始生長(zhǎng),糖濃在9 d內(nèi)消耗較快。發(fā)酵結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的耗糖量大小依次為對(duì)照組>Ca(OH)2脫毒組>活性炭脫毒組>未處理組。

    由圖5b可知,以酶水解液作為碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,Ca(OH)2脫毒組和對(duì)照組的糖濃走向基本一致,前3 d木醋桿菌耗糖較快,后期耗糖較慢。活性炭脫毒組前6 d,糖濃基本不變,從第6 d開(kāi)始耗糖量上升,且耗糖較快。未處理組的耗糖量從第9 d才開(kāi)始上升,前期木醋桿菌基本沒(méi)有生長(zhǎng)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的耗糖量大小依次為對(duì)照組>Ca(OH)2脫毒組>活性炭脫毒組>未處理組。

    圖5 各實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵過(guò)程中還原糖濃度的變化對(duì)照組活性炭脫毒組未處理組Ca(OH)2脫毒組

    圖6 各實(shí)驗(yàn)組純化凍干后的BC產(chǎn)量

    2.2.2 細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量

    如圖6所示,各實(shí)驗(yàn)組BC產(chǎn)量排序?yàn)镈2(酶解液Ca(OH)2脫毒組)>C2(酶解液活性炭脫毒組)>A(葡萄糖對(duì)照組)>D1(預(yù)處理液Ca(OH)2脫毒組)>B2(酶解液未處理組)>C1(預(yù)處理液活性炭脫毒組)>B1(預(yù)處理液未處理組)。

    未經(jīng)脫毒處理的酸預(yù)處理液和酶解液的BC產(chǎn)量都不高,主要原因推測(cè)是預(yù)處理液和酶解液中均含有酸預(yù)處理時(shí)形成的木質(zhì)纖維素衍生抑制物。木質(zhì)纖維類原料在高溫、低pH的條件下進(jìn)行預(yù)處理,一般會(huì)生成抑制物[25]。大豆渣中綜纖維素和木質(zhì)素經(jīng)過(guò)稀酸高溫高壓水解誘發(fā)一系列的副反應(yīng),生成呋喃醛(如糠醛和羥甲基糠酸等)和酚類等物質(zhì),這些物質(zhì)能抑制木醋桿菌生長(zhǎng)代謝,減少BC的產(chǎn)量[26-27]。另外,由于簡(jiǎn)單的水洗不能有效的去除附著在酶解底物濾渣上的抑制物,造成酶解液中還殘留一些抑制物;同時(shí)用活性炭處理的C1和C2兩組,C2的BC產(chǎn)量遠(yuǎn)大于C1,說(shuō)明酸預(yù)處理液中的發(fā)酵抑制物可能遠(yuǎn)多于酶水解液;D1和D2的BC產(chǎn)量分別是酸預(yù)處理液和酶解液發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中最高的,說(shuō)明Ca(OH)2的脫毒效果優(yōu)于活性炭脫毒,其中D2的BC產(chǎn)量5.52 g/L為最高,是葡萄糖對(duì)照組0.75 g/L的7.4倍,遠(yuǎn)高于對(duì)照組。這可能是因?yàn)槊附庖褐谐擞忻缸饔蒙傻钠咸烟堑忍且酝?,還產(chǎn)生了一些能促進(jìn)木醋桿菌生長(zhǎng)的低聚糖。另外大豆渣是一種天然產(chǎn)物,可能含有一些能夠適應(yīng)木醋桿菌的生長(zhǎng)因子,且酶解底物濾渣中氮元素含量為3.5%(元素分析儀測(cè)得),含氮豐富,有利于BC的合成;C2的BC產(chǎn)量是2.86 g/L,僅次于D2,是葡萄糖對(duì)照組的3.8倍,脫毒效果也較好,其余實(shí)驗(yàn)組的BC產(chǎn)量均低于葡萄糖對(duì)照組;其中,以預(yù)處理液作為碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組BC產(chǎn)量均低于以酶解液作為碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組,這可能是因?yàn)樗庖褐刑浅煞植町惔笤斐傻?。張碩等實(shí)驗(yàn)分析了七種糖類對(duì)木醋桿菌的影響,當(dāng)發(fā)酵初始糖濃為 25 g/L時(shí),木醋桿菌的BC產(chǎn)量排序依次為D-果糖>D-葡萄糖>D-木糖>D-半乳糖>L-阿拉伯糖>D-甘露糖[28],酸預(yù)處理過(guò)程水解的主要是半纖維素,降解后主要生成L-阿拉伯糖、木糖和半乳糖,預(yù)處理液中葡萄糖含量較少,而酶解液中的糖成分主要是葡萄糖。

    從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,以酶解液作為發(fā)酵碳源時(shí),Ca(OH)2脫毒后的BC產(chǎn)量是葡萄糖對(duì)照組的7.4倍,說(shuō)明以大豆渣作為發(fā)酵碳源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的效果明顯優(yōu)于以葡萄糖為碳源的,能有效降低BC生產(chǎn)成本,提高原料利用率。對(duì)比酶水解得到的碳源,雖然酸預(yù)處理液實(shí)驗(yàn)組的BC產(chǎn)量普遍偏低,但是作為豆渣原料的預(yù)處理工序,也產(chǎn)生了一定量的可發(fā)酵糖,提高了原料利用率。就兩種脫毒方法而言,Ca(OH)2脫毒法優(yōu)于活性炭脫毒。這與郭香在云杉水解液脫毒工作中得到的結(jié)果相同,說(shuō)明Ca(OH)2脫毒相對(duì)于其它方法普遍有效[15]。

    3 結(jié)論

    本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了酸或酶的催化劑濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)酸預(yù)處理和酶水解反應(yīng)的影響,研究比較了以葡萄糖、酸預(yù)處理液、酶解液作為碳源制備BC的產(chǎn)量。結(jié)果表明:用Ca(OH)2脫毒后的酶解液作為碳源,獲得的BC產(chǎn)量5.52 g/L最高,是對(duì)照組0.75 g/L的7.4倍,明顯優(yōu)于葡萄糖對(duì)照組。大豆渣價(jià)廉量大,稀酸預(yù)處理、酶水解過(guò)程操作簡(jiǎn)單,所以大豆渣是制備細(xì)菌纖維素的良好碳源,這為細(xì)菌纖維素的工業(yè)化低成本規(guī)模生產(chǎn)提供了一條新的路徑。

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