采用植物組織培養(yǎng)消毒技術(shù)分離河口地區(qū)香蕉內(nèi)生真菌的初步研究

張建春 柳青 李春 李芹

摘 要 對(duì)河口地區(qū)主栽的不同品種香蕉分3條線路進(jìn)行樣本采集，對(duì)采集到的香蕉組織進(jìn)行內(nèi)生真菌分離、鑒定，共分離到9屬494株內(nèi)生真菌。鑒定結(jié)果表明，刺盤孢屬（Colletotrichun sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、青霉屬（Penicillin sp.）為優(yōu)勢(shì)菌群。這3種優(yōu)勢(shì)菌群在東部路線、中部路線、西部路線的分離頻率分別為78.37%、79.55%、76.54%；在巴西蕉，威廉斯，紅研一號(hào)、紅研二號(hào)中的分離頻率分別為84.19%、77.32%、79.60%、71.48%。表明香蕉植株組織內(nèi)內(nèi)生真菌具有多樣性，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 河口 ；香蕉 ；內(nèi)生真菌 ；物種多樣性

分類號(hào) S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.015

Abstract The sample collection of different varieties of Banana was carried out from 3 lines， the endophytic fungi from the tissue specimens was isolated and identified. About 494 strains of endophytic fungi were obtained， they could be classified into 9 genera. Colletotrichun， Aspergillus and Penicillin were dominant fungi. The isolation frequency of these three dominat fungi in the eastern direction， central direction and western direction were 78.73%， 79.55% and 76.54%， respectively. The isolation frequency were 84.19%， 77.32%， 79.60% and 71.48% in varieties of BaXijiao， Weilians， Hongyan 1 and Hongyan 2. It was concluded that the endophytic fungi species of Banana plants in Hekou area had great diversity，which could provide references for the further research.

Key words Hekou ； banana plants ； endophyticfungi ； species diversity

內(nèi)生真菌是一類生活在健康植物組織內(nèi)，不引起明顯病害癥狀的微生物。國(guó)內(nèi)外有關(guān)香蕉內(nèi)生真菌的研究很少。2003年曹理想[1]采用分離法對(duì)華南地區(qū)健康香蕉根、葉內(nèi)生真菌及放線菌進(jìn)行了研究，楊佩文等[2]對(duì)云南不同地區(qū)香蕉根際內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離，得到了93株內(nèi)生真菌，并對(duì)次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了抑菌圈活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。2012年王宇光[3]對(duì)海南省香蕉內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離，得到了一株編號(hào)為KKWB-10的內(nèi)生菌，該菌對(duì)鐮刀菌四號(hào)小種具有一定的抗性。然而，河口地區(qū)香蕉植株組織內(nèi)生真菌的研究尚屬空白。多年香蕉病害研究發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)不同品種或同一品種不同地區(qū)香蕉抗病性都不一致，推測(cè)可能是由于內(nèi)生真菌的專一性和多樣性起關(guān)鍵作用。本文通過(guò)對(duì)河口縣不同地區(qū)、不同品種香蕉植株內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定，探討寄生在香蕉植株組織內(nèi)的內(nèi)生真菌是否具有寄主專一性及物種多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

按照河口“V”字型地形及海拔走勢(shì)，結(jié)合香蕉種植區(qū)的分布，主要選擇巴西蕉、威廉斯、紅研一號(hào)、紅研二號(hào)4個(gè)香蕉品種，東部、中部、西部3條大面積種植香蕉的路線為研究對(duì)象（東部路線選擇南溪鎮(zhèn)馬多依到龍堡村委會(huì)；中部路線選擇螞蝗堡農(nóng)場(chǎng)到南溪14隊(duì)；西部路線選擇壩灑農(nóng)場(chǎng)6隊(duì)到壩灑農(nóng)場(chǎng)7隊(duì)香蕉種植基地[4]。為了保證所取樣本能夠更全面代表河口地區(qū)，除以上3條主線外，其他地區(qū)也會(huì)隨機(jī)采集相關(guān)材料），進(jìn)行分離鑒定。

分離用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基（1 000 mL）：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

查氏培養(yǎng)基（1 000 mL）：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

采集不同生長(zhǎng)時(shí)期香蕉植株組織（香蕉根、假?gòu)健⑷~），先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理和表面消毒。具體方法：取新鮮、無(wú)蟲害的組織用肥皂水刷洗，清水沖洗干凈后，用消毒紙巾吸干水分，然后用75%酒精擦拭組織表面，無(wú)菌水沖洗3～4次，0.1%升汞浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗6～7次。在無(wú)菌操作條件下用滅菌解剖刀將香蕉組織切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，盛于滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，備用。

1.2.2 內(nèi)生真菌分離純化

將上述表面消毒處理過(guò)的香蕉組織小塊分別接種于PDA、查氏分離培養(yǎng)基平板上，置于25℃恒溫箱培養(yǎng)。2～3 d后，待邊緣長(zhǎng)出菌絲，用接種針挑取邊緣生長(zhǎng)良好的菌絲，接種在新的培養(yǎng)基平板上，待新接種的菌絲長(zhǎng)成菌落后，再挑取邊緣的菌絲培養(yǎng)。如此反復(fù)，得到純化的菌株，同時(shí)觀察記錄菌落的生長(zhǎng)情況及特征。挑取形態(tài)不同的菌落，轉(zhuǎn)入到PDA斜面培養(yǎng)基上，22～27℃條件下純化培養(yǎng)，保藏備用[5]。

1.2.3 菌株的鑒定

從純化數(shù)日的菌落上挑取菌絲連同孢子制成玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子梗、孢子形態(tài)、孢子與營(yíng)養(yǎng)體之間的著生方式，參照魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》和其他相關(guān)資料進(jìn)行鑒定，對(duì)不產(chǎn)孢菌落進(jìn)行人工誘導(dǎo)產(chǎn)孢。

對(duì)誘導(dǎo)仍不產(chǎn)孢的菌落提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，使用Vector NTI軟件與GenBank相關(guān)序列進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定其分類地位。

菌株分離頻率采用以下公式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 分離到的內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

所分離得到的內(nèi)生真菌通過(guò)提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank中已知序列進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。

由表2可知，三條路線上優(yōu)勢(shì)菌群相同，均為刺盤孢屬、曲霉屬和青霉屬，但分離頻率有所差別。刺盤孢屬中部和西部一樣（41.39%），東部最低（38.62%）；曲霉屬在中部路線分離頻率（25.72%）高于東部（23.13%）、西部（20.43%）；青霉屬在東部中最高（16.62%），西部次之（14.72%），中部最低（12.44%）。

2.2 相同路線不同品種分離到的內(nèi)生真菌情況

東部路線共分離得到149株內(nèi)生真菌，其中巴西蕉、威廉斯、紅研一號(hào)、紅研二號(hào)4個(gè)品種組織中分別分離到7屬31株、7屬36株、7屬38株、8屬44株內(nèi)生真菌。刺盤孢屬（Colletotrichun sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、青霉屬（Penicillin sp.）為優(yōu)勢(shì)菌群，其在4個(gè)香蕉品種組織中分離頻率分別為38.62%、23.13%、16.62%和9.65%。4個(gè)品種香蕉組織中均分離到擬青霉屬（Paecilomyces sp.），其中紅研二號(hào)中分離頻率遠(yuǎn)高于其他品種，為15.38%。

中部路線共分離到160株內(nèi)生真菌，其中巴西蕉、威廉斯、紅研一號(hào)、紅研二號(hào)4個(gè)品種組織中分別分離得到7屬36株、8屬40株、7屬41株、8屬43株內(nèi)生真菌。刺盤孢屬、曲霉屬、青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌群，其在4個(gè)香蕉品種組織中分離頻率分別為41.39%、25.72%、12.44%和9.35%。

西部路線共分離到185株內(nèi)生真菌，其中巴西蕉、威廉斯、紅研一號(hào)、紅研二號(hào)4個(gè)品種組織中分別分離得到8屬42株、9屬46株、9屬44株、9屬52株內(nèi)生真菌。刺盤孢屬、曲霉屬、青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌群，其在4個(gè)香蕉品種組織中分離頻率分別為41.39%、20.43%、14.72%和10.12%。紅研二號(hào)中分離得到8株擬青霉屬內(nèi)生真菌，分離頻率為15.38%，遠(yuǎn)高于其他品種。

2.3 相同品種不同路線分離到的內(nèi)生真菌情況

表3可以看出，在巴西蕉、威廉斯、紅研一號(hào)、紅研二號(hào)4個(gè)香蕉品種組織內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群相同，均為刺盤孢屬、曲霉屬、青霉屬，但分離頻率上有所差別，刺盤孢屬和曲霉屬分離頻率均為巴西蕉>紅研一號(hào)>威廉斯>紅研二號(hào)。青霉屬分離頻率威廉斯>紅研二號(hào)>紅研一號(hào)>巴西蕉。擬青霉屬在紅研二號(hào)組織中分離頻率高達(dá)15.38%，遠(yuǎn)高于其他品種，且相對(duì)于其他品種，紅研二號(hào)整個(gè)內(nèi)生真菌群落之間分離頻率要小于其他品種之間。

巴西蕉組織內(nèi)共分離得到109株內(nèi)生真菌，東部、中部、西部分別為7屬31株，7屬36株、8屬42株，刺盤孢屬、曲霉屬和青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌群。巴西蕉中三種優(yōu)勢(shì)菌群之和在東部、中部、及西部路線的分離頻率（CF）分別為83.87%、83.33%和85.36%。

威廉斯組織內(nèi)共分離得到122株內(nèi)生真菌，東部、中部、西部分別為7屬36株，8屬40株、9屬46株，刺盤孢屬、曲霉屬和青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌群。威廉斯中三種優(yōu)勢(shì)菌群之和在東部、中部、及西部路線的分離頻率（CF）分別為80.55%、77.5%和73.92%。

紅研一號(hào)組織內(nèi)共分離得到123株內(nèi)生真菌，東部、中部、西部分別為7屬38株，7屬41株、9屬44株，刺盤孢屬、曲霉屬和青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌群。紅研一號(hào)中三種優(yōu)勢(shì)菌群之和在東部、中部、及西部路線的分離頻率（CF）分別為76.32%、82.93%和79.54%。

紅研二號(hào)組織內(nèi)共分離得到139株內(nèi)生真菌，東部、中部、西部分別為8屬44株，8屬43株、9屬52株，刺盤孢屬、曲霉屬和青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌群。紅研二號(hào)中三種優(yōu)勢(shì)菌群之和在東部、中部、及西部路線的分離頻率（CF）分別為 72.72%、74.42%和67.31%。

3 討論

本文分離得到的內(nèi)生真菌種群和數(shù)量上均較少[1，6]，可能是由于所處環(huán)境高溫高濕，日常分離真菌易出現(xiàn)污染問(wèn)題。因此，此次分離內(nèi)生真菌時(shí)參考中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園分離榕樹癮頭果內(nèi)生真菌的方法，使用升汞消毒10 min。由于所消毒材料不同，導(dǎo)致消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分種類內(nèi)生真菌被殺死，使得內(nèi)生真菌種類大大減少。

通過(guò)河口地區(qū)3條線路采集不同品種香蕉植株組織進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，共分離得到內(nèi)生真菌9屬494株，其中刺盤孢屬、曲霉屬、青霉屬優(yōu)勢(shì)菌群，普遍存在于整個(gè)河口地區(qū)4個(gè)主要品種香蕉組織中。除優(yōu)勢(shì)菌群外，還分離到小竇氏霉屬、鐮刀菌屬、交鏈孢屬、痂圓孢屬、短梗霉屬和少量還無(wú)法鑒定出來(lái)的真菌，表明河口香蕉植株組織內(nèi)內(nèi)生真菌具有多樣性。不論是從不同路線還是不同品種香蕉對(duì)比，內(nèi)生真菌群落基本相同，只有分離頻率存在差異，但差異不大?？梢?jiàn)，同一地區(qū)同屬植物組織內(nèi)部環(huán)境中，不同微生物的相互作用，會(huì)建立某種平衡關(guān)系，優(yōu)勢(shì)種群相對(duì)穩(wěn)定，分離頻率較高，形成了相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)生真菌群落[7-8]。而稀有種群，當(dāng)樣本量不夠大時(shí)，可能會(huì)被遺漏[6，9]。

紅研二號(hào)在大田適應(yīng)性試驗(yàn)種植中，表現(xiàn)出耐葉斑病特性。從分離到的內(nèi)生真菌來(lái)看，紅研二號(hào)中分離得到的內(nèi)生真菌種群數(shù)量較多。在植物體組織內(nèi)的微生物群落中，微生物種群數(shù)量越多則多樣性越高，植物生態(tài)系的功能與結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，則越不易感病[10]。

對(duì)整個(gè)河口地區(qū)不同品種香蕉組織進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，除少數(shù)幾份未鑒定出以外，其他已鑒定的均為常見(jiàn)內(nèi)生真菌，在其他植物組織內(nèi)均有報(bào)道，并未發(fā)現(xiàn)特有真菌。因此，目前還不能確定香蕉植株組織中是否存在內(nèi)生真菌的寄主專一性。隨著研究的不斷深入及樣本不斷的采集，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一些特有的種群，為香蕉內(nèi)生真菌多樣性或寄主專一性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 曹理想，田新莉，周世寧. 香蕉內(nèi)生真菌、放線菌類群分析[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，42（2）：70-73.

[2] 楊佩文，番華彩，金桂梅，等. 香蕉根際及內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物抑菌圈活性測(cè)定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（5）：1 888-1 892.

[3] 王宇光，顧文亮，張 欣，等. 香蕉內(nèi)生拮抗細(xì)菌KKWB-10的分離鑒定及其內(nèi)生性證明[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（24）：183-187.

[4] 楊紹瓊，陳偉強(qiáng)，鄧成菊，等. 云南河口地區(qū)香蕉黑星病與炭疽病發(fā)生規(guī)律的再研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，35（2）：45-50.

[5] 席儀翠，陳吉岳，楊大榮，等. 對(duì)葉榕隱頭果內(nèi)寄生真菌的來(lái)源[J]. 動(dòng)物學(xué)研究，2009，30（增刊）：154-157.

[6] 王夢(mèng)穎. 香蕉內(nèi)生菌多樣性分析及廣譜拮抗菌篩選[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2014.

[7] 李雪玲. 八角蓮植株地下莖內(nèi)生真菌的分離[J]. 云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，25（2）：49-52.

[8] 文才藝，吳元華，田秀玲. 植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問(wèn)題[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（2）：86-91.

[9] 王利娟，賀新生. 植物內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)的研究方法[J]. 微生物學(xué)雜志，2006，24（6）：55-60.

[10] 林時(shí)遲，張紹升，周樂(lè)峰. 福建省香蕉枯萎病鑒定[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29（4）：465-469.