海南不同產(chǎn)地草豆蔻的差異蛋白分析

吳秀麗 王旭初 段紅葉 李建玲 何文英

摘 要 草豆蔻為典型的藥食同源植物，關(guān)于其主要的化學(xué)成分已早有研究，但對其含有的植物蛋白卻鮮有研究。本研究首次探索了海南地道草豆蔻（白沙和霸王嶺2個產(chǎn)地）中所含蛋白信息。應(yīng)用雙向電泳進(jìn)行蛋白分離得到相應(yīng)全蛋白圖譜，并用Image Master5.0軟件比較篩選出不同產(chǎn)地的高豐度差異蛋白，通過基質(zhì)輔助激光解析-電離飛行時間質(zhì)譜分析（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrum， MALDI-TOF MS）及Mascot Distiller軟件對蛋白進(jìn)行搜庫。結(jié)果顯示：2個不同產(chǎn)地草豆蔻共有40個高豐度差異蛋白，去除相同的蛋白，經(jīng)分析確定這些差異蛋白歸屬22種植物蛋白，主要涉及植物的抗菌活性、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞分裂增殖及對植物物理性狀的影響等方面。首次發(fā)現(xiàn)某些差異蛋白可能具有一定的抗菌活性，如11、12及13號的類似豌豆的抗菌肽段，7或25號的纖維狀細(xì)胞分裂蛋白， 24號的泛素蛋白連接酶E3，31號的小分子熱休克蛋白，14及35號的谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶。這些差異蛋白均與草豆蔻極其主要的活性組份所具有的抗炎抑菌、毒性低等的特點(diǎn)相關(guān)。本研究結(jié)果不僅是對草豆蔻所含物質(zhì)中的生物大分子種類的補(bǔ)充和完善，同時也體現(xiàn)了不同產(chǎn)地草豆蔻的生物多樣性特點(diǎn)，為深入利用、研究這種藥食同源的植物及全面了解其藥理活性提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 海南草豆蔻 ；蛋白圖譜 ；差異蛋白

中圖分類號 Q949.71+8.33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.011

Abstract As a typical plant that had the homology of medicine and food， Alpinia Katsumadai had been studied on its main chemical components. But there was few research about vegetable proteins. The protein information of Alpinia Katsumadai in Hainan Baisha and Bawangling were investigated in this paper. The protein profiles of Hainan Alpinia Katsumadai were obtained by 2-dimensional polyacryamide gel electrophoresis （2-DE） technique. The high abundance proteins in different habitats were compared and screened out by software Image Master5.0.The protein database was searched by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry （MALDI-TOF MS） and the software Mascot Distiller. The results indicated that there were 40 high abundance proteins of Alpinia Katsumadai in two areas. The identical proteins were removed and the identified proteins were assigned to 22 kinds of proteins which related to the antimicrobial activity of plant， stress response， cellular differentiation and proliferation， physical characteristics. Some differential proteins were found to have certain antimicrobial activity.They were antimicrobial peptides of 11， 12 and 13 protein spots， cell division protein FtsZ of 7 and 25 protein spots， E3 ubiquitin-protein ligase of 24 protein spot， 17.7 kDa heat shock protein of 31 protein spot and glutathione S-transferase of 14 and 35 protein spots. These differential proteins were related with the anti-inflammatory and bacteriostasis and low toxicity of Alpinia Katsumadai. This paper filled the information of biomolecules of Alpinia Katsumadai and illustrated the biological diversity features of Alpinia Katsumadai in different habitats. The study may provide scientific basis for further development and utilization of Alpinia Katsumadai and fully understand its pharmacological activities.

Keywords Alpinia Katsumadai ； protein profiles ； differentially expressed proteins

草豆蔻為姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）的干燥近成熟種子，具有濕胃止嘔、燥濕健脾功效；臨床上用于治療脘腹脹滿冷痛、寒濕內(nèi)阻、不思飲食、暖氣嘔逆；民間食用方法是作為調(diào)料。目前已知草豆蔻主要含揮發(fā)油與黃酮類成份，主要活性組份包括黃酮類的山姜素和查耳酮類的豆蔻明，其藥理活性主要表現(xiàn)在抑制腫瘤的形成、抑制血小板聚集及抗炎抑菌等的方面，且安全性好，毒性很低[1]。作為一種傳統(tǒng)的藥食同源品種，國內(nèi)外對草豆蔻及其主要組份的研究主要集中在成份分析及藥理活性方面[2-3]，但應(yīng)用基于雙向電泳技術(shù)（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）的蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究草豆蔻的蛋白圖譜及不同地域草豆蔻的差異蛋白卻未見報道。尤其近年來，2-DE技術(shù)在植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛和深入。Wang等[4-5]、Yi等[6]應(yīng)用雙向電泳技術(shù)，通過蛋白分離提取、質(zhì)譜技術(shù)鑒定分析了鹽生植物海蓮子、海馬齒葉、小鹽芥葉等的差異顯示蛋白；相關(guān)學(xué)者針對多種作物（木薯、玉米、向日葵、人參等），應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件及方法，研究了不同優(yōu)化雙向電泳條件下的蛋白提取結(jié)果，利用質(zhì)譜鑒定分析了其中的差異蛋白[7-10]。樊帆等[11]分析了清水引發(fā)和藤茶提取物二氫楊梅素引發(fā)提高水稻劣變種子發(fā)芽率的蛋白質(zhì)組學(xué)。李艷霞等[12]就香蕉后熟果皮差異蛋白分析及其基因克隆進(jìn)行了研究。以上眾多研究表明，作為最初聚焦基礎(chǔ)研究的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從描述在特定狀態(tài)或特定時期下，一種生物體的某一細(xì)胞或某一組織的基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，及其這些蛋白質(zhì)的活性或存在方式，到當(dāng)今應(yīng)用于直觀揭示各種生物體的全蛋白種類及歸屬，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了其在實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域的拓展[13]。海南以其獨(dú)特的地理環(huán)境條件，在許多地區(qū)盛產(chǎn)草豆蔻，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析其全蛋白圖譜及不同產(chǎn)地草豆蔻的差異蛋白，可獲知不同地域、不同環(huán)境條件對草豆蔻生命過程的影響情況；從蛋白質(zhì)水平揭示各種生理過程的分子機(jī)理，為補(bǔ)充認(rèn)識草豆蔻的藥效作用、進(jìn)一步研究開發(fā)及利用草豆蔻奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

蛋白質(zhì)雙向電泳儀（美國通用公司GE Healthcare）；蛋白質(zhì)單向電泳儀（美國通用公司GE Healthcare）；Image scanner III掃描儀（美國通用公司GE Healthcare）；SIGMA 3-18K低溫超速離心機(jī)（德國SIGMA）；MultiTemp IV恒溫循環(huán)器（美國通用公司GE Healthcare）；臺式恒溫振蕩器（上海精宏）；EYELA搖床（東京理化）；渦旋混合器QL-866（海門其林貝爾）；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津津騰）；UV-2700紫外分光光度計（日本島津）；ImageMaster5.0凝膠圖像分析軟件；Voyager-DE PRO ABI4700時間飛行質(zhì)譜儀（美國ABI公司）；KQ2200E型超聲波清洗器（曙峰企業(yè)）。

蛋白Maker（Fermentas預(yù)染蛋白Marker 10-170KD，廣州翔博生物科技有限公司），牛血清蛋白（美國Simga）。所有實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.1.2 草豆蔻樣品

經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)院的鐘瓊芯教授推薦可知，海南霸王嶺和白沙縣境內(nèi)有一定量的野生草豆蔻，具有典型的地域代表性。在專業(yè)采藥人的幫助下，于2015年5月采集到了生長于海南霸王嶺和白沙縣的草豆蔻樣品，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)院的鐘瓊芯教授鑒定確為姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）的種子團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 草豆蔻蛋白樣品制備

將當(dāng)天采集的草豆蔻種子樣品附著的雜質(zhì)用超純水沖洗干凈，分裝、標(biāo)記樣品并迅速放入-80℃冰箱儲存。利用酚抽提法提取，分別取出凍干的不同產(chǎn)地的草豆蔻種子樣品，用液氮和石英砂將草豆蔻種子研磨成粉末；稱2 g研磨好的樣品粉末，加入7 mL預(yù)冷BPP提取緩沖液和7 mL Tris飽和酚，室溫渦旋震蕩，分別震蕩10和5 min，在4 ℃、16 000 g條件下離心15 min；每1 mL上清液加入5 mL預(yù)冷過的飽和硫酸銨甲醇溶液（AM沉淀劑），放置-20 ℃沉淀過夜；在4 ℃、16 000 g條件下離心15 min；去除上清液，分別依次加入2 mL的-20 ℃預(yù)冷甲醇和2 mL預(yù)冷丙酮，攪碎蛋白，在4 ℃、16 000 g條件下離心5 min，各重復(fù)2次，去上清液；再將沉淀蛋白室溫下自然風(fēng)干，加入10 μL/mL PMSF，10 mg/mL DTT，混合均勻，再按10 mg樣品/mL配制得蛋白裂解液，置于20℃恒溫溶解2 h；在20 000 g、20℃條件下離心30 min，分裝于1.5 mL離心管，依據(jù)Bradford方法測定蛋白濃度[14]，于-20℃保存。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的測定：從儲備液中移取0、6、12、18、24、30 μL溶液，用Bradford溶液定容至3 mL，即配制成0、2、4、6、8、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度；利用紫外分光光度法測定595 nm處吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

取3 μL待測蛋白樣品用Bradford溶液定容至3 mL，根據(jù)Bradford法[14]，使用紫外分光光度計，測定蛋白樣品溶液在595 nm處的紫外吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算樣品中蛋白質(zhì)的含量；根據(jù)蛋白質(zhì)定量的結(jié)果取適量蛋白液進(jìn)行后續(xù)電泳實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 單向電泳實(shí)驗(yàn)[14-15]

在蛋白質(zhì)單向電泳儀上進(jìn)行，采用垂直平板裝置，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，濃縮膠為5%。將不同產(chǎn)地的草豆蔻蛋白樣品上樣，上樣量均為30 μg，分別加入6個梳子的進(jìn)樣孔中，每個樣品重復(fù)3次；蛋白Maker事先煮沸5 min；電泳參數(shù)設(shè)置為：先以5 W的功率電泳1 h，再改用7 W的功率，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至距下沿1.5 cm處停止電泳；取出凝膠，于25℃恒溫振蕩染色3 h后脫色，并在膠片觀察燈下拍照。

1.2.4 2-DE實(shí)驗(yàn)[15]

（1）等電聚焦。在一次性水化盤內(nèi)采用膠內(nèi)水化方式進(jìn)行上樣，先以20 ℃恒溫水化18 h；待水化結(jié)束后，再將膠條轉(zhuǎn)移至Ettan IPGphor3聚焦儀上。聚焦程序設(shè)置參數(shù)為：表面溫度20 ℃，電流強(qiáng)度50 μA/膠條，250 V，3 h；500 V，2 h；1 000 V，1 h；1 000～8 000 V，3 h；8 000 V，12 h，分別聚焦至VhT為120 000。

（2）膠條平衡及聚丙烯胺凝膠制備。將等電聚焦結(jié)束后的膠條分別置于平衡緩沖液[1 % DTT，6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.8），2 % SDS，30 %甘油，0.002 %溴酚藍(lán)，4 %碘乙酰胺]中，平衡15 min，再在垂直電泳儀上進(jìn)行雙向電泳操作。電泳設(shè)置條件為：保持循環(huán)水浴溫度16 ℃，以5 W/膠進(jìn)行1 h，再以7 W/膠繼續(xù)電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至距下沿1.5 cm處停止電泳。

（3）凝膠染色和脫色。在500 mL染色液A和500 mL染色液B等體積混合的溶液中進(jìn)行。其中，染色液A的配方為：甲醇100 mL、考馬斯亮藍(lán)G250為1.25 g、乙醇300 mL、ddH2O為100 mL；染色液B的配方為：59 mL 85 %磷酸、100 g硫酸銨。在室溫下染色12 h，再進(jìn)行2次脫色（20 min）（脫色液的配方為：100 mL無水乙酸、600 mL無水乙醇，以ddH2O定容到2 L）。

（4）凝膠掃描和圖像分析。采用Image Scanner III掃描儀掃描，用Image Master5.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，篩選不同產(chǎn)地樣品的高豐度差異蛋白點(diǎn)，并挖取這些差異蛋白點(diǎn)，分別放入不同的樣品管中。

1.2.5 酶切及質(zhì)譜測定

（1）酶切。將得到的差異蛋白點(diǎn)先進(jìn)行脫色處理：分別加入150 μL脫色液（50 % 100 mmol/L NH4HCO3，50 % ACN），以150 r/min轉(zhuǎn)速震蕩30 min，吸出脫色液，重復(fù)該步驟2～3次，直至膠粒顏色變?yōu)橥该?；再分別加入150 μL ddH2O，重復(fù)3次，去除干凈樣品中的NH4HCO3；加入100%乙腈100 μL，以150 r/min轉(zhuǎn)速震蕩15 min，重復(fù)2次，直至膠粒變?yōu)榧儼咨?，將樣品風(fēng)干；分別加入胰蛋白酶緩沖液6 μL，在PCR儀上酶解13 h（37℃）；將酶解后的蛋白離心（在20℃、10 000 g的條件下離心5 min），收集上層酶解液，轉(zhuǎn)移至干凈PCR管中，用于質(zhì)譜鑒定。

（2）MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定及蛋白數(shù)據(jù)庫搜索。在ABI 4700時間飛行質(zhì)譜儀上進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。設(shè)置參數(shù)：Nd為YAG激光器，335 nm，200 Hz激光激發(fā)。將所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Mascot Distiller軟件進(jìn)行分析，在Matrix Science網(wǎng)站（http：//www.matrixscience.com）輸入數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索比對，獲得各差異蛋白的名稱及序列等信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 草豆蔻蛋白單向電泳圖譜分析

為優(yōu)化雙向電泳的實(shí)驗(yàn)條件，首先需要進(jìn)行單向凝膠電泳的檢測，以確定所提取的草豆蔻種子蛋白質(zhì)是否會降解。圖1為不同產(chǎn)地草豆蔻和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)記樣品單向電泳圖，使用NL pH3-10的24 cm IPG膠條，455 μL上樣體積中蛋白量為1 300 μg。從圖中可以看出，2個產(chǎn)地的蛋白圖譜非常相似，暗示其具有相似的蛋白或分子量；與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比，2個產(chǎn)地的蛋白質(zhì)條帶清晰，證明草豆蔻蛋白質(zhì)沒有降解，且干擾雜質(zhì)含量較少，可以進(jìn)行雙向電泳。從分子量的分布看，2個產(chǎn)地的草豆蔻所含蛋白質(zhì)分子量主要介于20～60 ku，這與后續(xù)的雙向電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，但由于本實(shí)驗(yàn)所用的是非線性膠條（pH3-10），故一些特征堿性蛋白可能會被漏檢。

2.2 草豆蔻蛋白雙向電泳圖譜分析

采用酚抽提法，將海南霸王嶺和白沙2地產(chǎn)的草豆蔻種子進(jìn)行優(yōu)化處理，除去揮發(fā)油等雜質(zhì)，得到純度比較高的蛋白樣品，并獲得蛋白圖譜（圖2，3），其中圖2為霸王嶺草豆蔻蛋白2-DE圖識別626蛋白點(diǎn)（重復(fù)3次平均值），圖3為白沙草豆蔻蛋白2-DE圖識別670蛋白點(diǎn)（重復(fù)3次平均值）。從圖中可看出，2種草豆蔻種子的蛋白表達(dá)圖譜非常相似，蛋白點(diǎn)多集中在pH 4～7。用Image Master5.0圖像分析軟件在等電點(diǎn)為4.0～10.0、分子量為14.4～97.4 ku的圖譜上，將霸王嶺和白沙2個產(chǎn)地草豆蔻的蛋白圖譜進(jìn)行比較分析，自動檢測結(jié)合人工去除，分別保留高清晰且重復(fù)性強(qiáng)的蛋白點(diǎn)，兩者匹配率大于85 %，可作為差異蛋白；通過進(jìn)一步分析對比，共獲得40個差異蛋白點(diǎn)。對40個高豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜測定，確定所屬的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示1～20號為霸王嶺草豆蔻蛋白點(diǎn)，21～40號為白沙草豆蔻蛋白點(diǎn)（表1）。表2為從差異蛋白中所檢測到的肽段序列及其占目標(biāo)蛋白多肽序列的百分比和分值等信息。

2.3 差異蛋白的功能分析

通過比較2個不同產(chǎn)地的蛋白圖譜及高豐度差異蛋白可知，其相似點(diǎn)是：不同產(chǎn)地的草豆蔻2-DE圖譜較相似；這些高豐度差異蛋白絕大多數(shù)均在其他植物中有存在，涉及植物生長發(fā)育過程中的不同功能。不同點(diǎn)是：霸王嶺草豆蔻蛋白與白沙的有較多重疊，但白沙的更為獨(dú)特些。從表1中顯示的海南霸王嶺和白沙草豆蔻的高豐度差異蛋白看，除了10號蛋白點(diǎn)通過分析被鑒定為Papilio polytes（玉帶鳳蝶）中所含蛋白，其他的39個蛋白點(diǎn)都?xì)w屬為植物蛋白。由于玉帶鳳蝶為常見鳳蝶屬物種，寄主植物多為木蘭科植物和蕓香科植物[16]，推測海南草豆蔻可能為玉帶鳳蝶的一種寄主植物，因此造成對草豆蔻樣品的污染。針對表1中有確切名稱的蛋白，做如下簡要的功能分析。

1號蛋白點(diǎn)屬鋅指蛋白類，植物的鋅指蛋白通過特殊的富含精氨酸結(jié)構(gòu)域的一類蛋白過表達(dá)，從而影響植物的激素調(diào)控、生長發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)及轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)等。眾多研究已表明，鋅指蛋白可通過基因表達(dá)控制種子的發(fā)芽、植物的表型、開花的時間、生命及非生命體的壓力反應(yīng)等[17]。

7或25蛋白點(diǎn)屬纖維狀細(xì)胞分裂蛋白，屬具有鳥苷三磷酸酶活性的高度保守的真核細(xì)胞分裂蛋白，它存在于多種細(xì)菌的細(xì)胞壁，比如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、無膽甾原體、鹽沼鹽桿菌、熱細(xì)菌、結(jié)核桿菌甚至古生菌域等的細(xì)胞壁，是有望發(fā)現(xiàn)新一代抗菌藥物的新靶標(biāo)[18]。

11、12及13號蛋白點(diǎn)為類似豌豆的抗菌肽段，近年來，由于抗菌肽段具有廣譜和快速抗菌的效果，已引起了研究者的廣泛關(guān)注，尤其是抗菌肽段能針對抗藥性病原菌，與傳統(tǒng)的抗生素類藥物起協(xié)同作用。從其結(jié)構(gòu)看，抗菌肽段具有多樣性序列，含有大量帶負(fù)電荷的疏水氨基酸殘基（磷脂雙層結(jié)構(gòu)），有助于選擇性地抵抗致命性病菌。有些抗菌肽段通過非膜透化機(jī)制，不經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)膜而直接作用于細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。除了以上所表現(xiàn)的直接抗菌活性，抗菌肽段還能抑制菌膜的形成及破壞成熟的菌膜。此外，抗菌肽段這種多功能生物大分子還具有多樣性的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，比如對趨化因子表達(dá)的修飾、促進(jìn)傷口愈合及血管生成、降低促炎調(diào)節(jié)等，以此來對細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖和脂磷壁酸）作出應(yīng)激反應(yīng)[19]。

14及35號蛋白點(diǎn)為谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GSTs），在原核生物及真核生物（高等植物、昆蟲和哺乳動物）中廣泛存在。其主要生物學(xué)功能為解毒作用，解毒的對象主要包括除草劑、農(nóng)藥、誘變劑和致癌物等。對植物體內(nèi)GSTs的研究從20世紀(jì)70年代對玉米抗除草劑阿特拉津的研究開始，隨后逐漸在高粱、大豆、甘蔗、煙草、豌豆等作物及高等植物體內(nèi)相繼發(fā)現(xiàn)了GSTs的活性，尤其在高等植物中，GSTs在植物體抵御外源物質(zhì)傷害或?qū)Χ喾N逆境的應(yīng)激抗性中均發(fā)揮重要的作用；也有研究表明，GSTs的活性還涉及植物對熱激作用、病原菌因子、重金屬離子及外源植物激素的抵御抗毒作用，并且這些作用正日益受到研究者的重視[20]。

15號蛋白為硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，硫是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，它不僅對植物有直接的營養(yǎng)作用，還可以提高植物的水分利用率，有利于植物對干旱逆境的適應(yīng)。通過核酸序列研究發(fā)現(xiàn)，植物硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由分子量為70～74 ku的單一肽鏈組成，并且所有植物中的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與其他種類生物的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有著高度的保守性和相似性，依據(jù)高親和性和低親和性一般劃分為5個亞群。硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)功能，是依賴于一個H+泵維持的膜間電勢梯度的H+/SO42-共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[21]。

17及20號蛋白為類似谷蛋白。谷蛋白是小麥面粉的主要蛋白成分，與小麥的粘性有關(guān)，占10%～15%左右。在草豆蔻中發(fā)現(xiàn)了谷蛋白說明其同為種子類植物，草豆蔻含有與小麥谷蛋白相似的蛋白，有待進(jìn)一步深入對其開展提純研究[22]。

18及40號蛋白為類似豆球蛋白。扁豆的類似豆球蛋白等電點(diǎn)在4.6左右，其包含約38 %的親水氨基酸殘基和40 %的疏水氨基酸殘基。因此在pH值與其等電點(diǎn)相差較大的條件下，類似豆球蛋白可顯示出良好的界面疏水性和可溶性，可將其應(yīng)用于食品加工過程中，調(diào)節(jié)pH值5或7時可得到最佳的起泡效果，豆球蛋白的功能主要是凝膠性和乳化性[23]。從草豆蔻中檢出的類似豆球蛋白等電點(diǎn)在5.89左右，分子量約為42 ku，說明其與扁豆有所差別，有待進(jìn)一步研究。

22號蛋白屬過氧化物酶體蛋白，存在于一切真核細(xì)胞內(nèi)。植物過氧化物酶體呈現(xiàn)高度的組織專業(yè)化特點(diǎn)，可分為4種不同類型：無差別型植物過氧物酶體；富含脂肪酸氧化的乙醛酸循環(huán)酶及乙醛酸循環(huán)酶；存在于光合作用組織、涉及乙醇酸代謝的葉子過氧化物酶體；主管光呼吸及根結(jié)節(jié)的過氧化物酶體。其主要功能為：參與光呼吸作用，將光合作用的副產(chǎn)物乙醇酸氧化為乙醛酸和過氧化氫；在種子萌發(fā)的過程中進(jìn)行脂肪酸的氧化，完成乙醛酸循環(huán)[24]。

24號蛋白為泛素蛋白連接酶E3，是真核生物體內(nèi)最重要的蛋白降解所需酶類之一，具有高度選擇性。E3能夠特異性識別并結(jié)合目標(biāo)蛋白，可分為環(huán)指結(jié)構(gòu)域、U形箱式結(jié)構(gòu)域、F形箱式結(jié)構(gòu)域及HECT結(jié)構(gòu)域共3種結(jié)構(gòu)域蛋白家族，其通過形成不同結(jié)構(gòu)域的復(fù)合體發(fā)揮生物功能，主要涉及細(xì)胞的分裂和分化、蛋白的磷酸化修飾、異常細(xì)胞的增殖和消除、抗病原體感染等[25]。

31號蛋白為小分子熱休克蛋白。自然界所有的原核和真核生物都有熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP），是一組具有重要生理功能、高度保守的蛋白質(zhì)分子家族，生理、病理及環(huán)境因素等都可誘導(dǎo)熱休克蛋白的產(chǎn)生。小分子熱休克蛋白是植物在應(yīng)對熱休克反應(yīng)時合成的一種重要的應(yīng)激蛋白，有研究表明，通過測定植物花、果實(shí)或種子中HSP的表達(dá)可以證明植物在遭受水壓、光、有機(jī)或無機(jī)物脅迫時也會合成這種小分子蛋白。熱休克蛋白主要功能為：提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性；維持細(xì)胞蛋白的結(jié)構(gòu)功能；參與免疫調(diào)節(jié)等[26]。

從以上分析結(jié)果可知，有些差異蛋白具有不同的抗菌、提高免疫或抵御抗毒的作用，比如編號為11、12、13的蛋白為類似豌豆球蛋白抗菌肽，暗示霸王嶺草豆蔻中的這幾種蛋白可能具有一定的抗菌活性，需要進(jìn)一步深入研究，本課題組后續(xù)研究的內(nèi)容是應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析海南草豆蔻的全蛋白，系統(tǒng)地得到它們的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜，并針對這幾種抗菌肽蛋白設(shè)計試驗(yàn)，驗(yàn)證其藥物活性。

3 結(jié)論

通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法，應(yīng)用雙向電泳提取分離了海南不同產(chǎn)地草豆蔻的蛋白，獲得了40個從屬于22種植物的差異顯示蛋白，這些差異蛋白涉及草豆蔻的不同生物功能，主要表現(xiàn)在植物的應(yīng)激反應(yīng)、抗菌活性、細(xì)胞分裂增殖及對植物物理性狀的影響等方面。結(jié)合草豆蔻極其主要的活性組份具有抗炎抑菌、毒性低等的特點(diǎn)，預(yù)測這些差異蛋白也可能具有一定的抗菌活性，包括11、12及13號的類似豌豆的抗菌肽段；7或25號的纖維狀細(xì)胞分裂蛋白；24號的泛素蛋白連接酶E3；31號的小分子熱休克蛋白；14及35號的谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶。本研究結(jié)果獲得了海南草豆蔻的蛋白信息，補(bǔ)充和完善了草豆蔻中所含物質(zhì)的研究，從一定程度上反映了不同產(chǎn)地的草豆蔻的生物多樣性特點(diǎn)，為進(jìn)一步探索這種藥食同源的植物提供了科學(xué)合理的理論指導(dǎo)。

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