健骨顆粒對鈦顆粒誘導的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK mRNA的調(diào)控作用

林麗瓊，林 煜，肖莉莉，馮爾宥，王武煉，張怡元

（廈門大學附屬福州第二醫(yī)院，福建 福州 350007）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療終末期關(guān)節(jié)疾病成功有效的方法，假體周圍骨溶解是引起人工關(guān)節(jié)假體無菌性松動、關(guān)節(jié)置換術(shù)中晚期失敗的最主要原因［1］。假體磨損表面釋放顆粒誘發(fā)炎性反應，促進破骨細胞活化成熟，引起假體周圍骨溶解吸收［2］。目前無法完全避免假體材料產(chǎn)生磨損顆粒，缺乏有效的預防手段，因此尋找防治假體周圍骨溶解的藥物是降低假體松動發(fā)生率的研究難點及熱點。OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)是參與骨溶解的核心信號通路［3］，成骨細胞表面分泌核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-кB ligand，RANKL）可與破骨細胞或破骨前體細胞表面的核因子-κB受體活化因子（receptor activator of NF-кB，RANK）結(jié)合，促進破骨細胞的分化成熟，并抑制其凋亡；成骨細胞分泌骨保護素（osteoprotegerin，OPG）可競爭性結(jié)合RANKL，阻止RANKL與RANK的結(jié)合，從而阻斷骨溶解信號通路，起骨保護作用。前期研究表明，健骨顆粒含藥血清可抑制體外成骨樣細胞RANKL mRNA表達，促進OPG mRNA表達，競爭性結(jié)合RANKL，抑制骨吸收信號的傳遞，抑制破骨細胞的生成、活性，從而抑制骨吸收［4-5］。本實驗通過研究健骨顆粒對鈦顆粒誘導的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)相關(guān)因子的影響，以期為其防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動提供實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級3月齡雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（290±20）g，由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（閩）2012-0001，飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥研究院比較醫(yī)學中心，合格證號：醫(yī)動學第23-016號，實驗動物自由飲水進食。

1.2 實驗藥物 健骨顆粒由煅狗骨、淫羊藿、黨參、山茱萸、淮山藥等藥物組成，原藥材購自福建省藥材公司，由福建省中醫(yī)藥研究院試車間加工制備，每克健骨顆粒含生藥2.9 g。

1.3 實驗試劑 鈦顆粒（瑞士普魯斯外科植入物有限公司）；水合氯醛、多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司）；HE染液（北京索萊寶科技有限公司）；TRIzol（美國 invitrogen 公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本 Takara 公司）；SYBRTMPremix Ex TaqTM（日本Takara公司）。

1.4 實驗儀器 TS-12U生物組織脫水機、BM-VⅡ石蠟包埋機（孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；RM2235石蠟切片機、DM4000B正置顯微鏡（德國Leica公司）；Infinite M200酶標儀（瑞士Tecan公司）；2 000超微量分光光度計（美國 Nanodrop公司）；S1000PCR擴增儀（美國BIO-RAD公司）；7 500 Fast熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 鈦顆粒混懸液制備 磨損顆粒采用鈦顆粒，平均直徑小于10 μm。將鈦顆粒置于180℃烤箱6 h，70%乙醇浸泡48 h，PBS洗滌，梯度離心，無水乙醇浸泡24 h，沉淀鈦顆粒，去除無水乙醇后自然干燥，精密天平分裝成30 mg／包，高壓蒸汽滅菌30 min，60℃恒溫箱烘干后，4℃保存?zhèn)溆?。鈦顆粒通過內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測鈦微粒內(nèi)毒素＜0.25 Eu／mL。臨用前加入生理鹽水配置成10 mg／mL的鈦顆?；鞈乙?。

2.2 動物分組及模型制備 大鼠適應性喂養(yǎng)1周，完全隨機法選取10只取其顱骨作為植骨的供體，隨機選取30只分為對照組、模型組、健骨顆粒組各10只。大鼠脫頸椎處死，沿顱正中線剪開皮膚，分離顱骨，將顱骨修成4 mm×3 mm大小，完整保留顱骨表面骨膜，置于無菌生理鹽水中備用。

參照文獻［6］制備植骨氣囊骨溶解模型，以大鼠背部正中線距尾根部10 cm為中心，電動剃毛刀剃毛，背部備皮消毒，每天皮下注射無菌空氣，每次1 mL，連續(xù)5天，形成氣囊，建立氣囊模型；大鼠禁食不禁水，稱重，10%水合氯醛按0.3 mL／100 g劑量腹腔注射麻醉，碘伏消毒，鋪無菌單，沿氣囊邊緣作切口，將顱骨片植入氣囊中心，每只大鼠植入1片顱骨片，縫合切口，建立氣囊植骨模型。對照組大鼠氣囊內(nèi)注射0.5 mL生理鹽水，模型組、健骨顆粒組氣囊內(nèi)注射0.5 mL鈦顆粒懸液，建立骨溶解病理模型。

2.3 藥物干預 術(shù)后24 h進行藥物干預，大鼠灌胃劑量按實驗動物體表面積換算，健骨顆粒組按2 g／（kg·d）予健骨顆?；鞈乙汗辔?，對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃2周。實驗大鼠均在相同條件下自由攝食、飲水。灌胃結(jié)束后取材，取出完整氣囊，將樣本一切為二，一份置于4%多聚甲醛中固定備用；一份過液氮置于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 HE染色 將樣本置于4%多聚甲醛中室溫下固定24 h后，10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣4周；水洗，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋；以顱骨矢狀面為切面，6 μm厚度連續(xù)切片，切片脫蠟至水，Ehrlich蘇木素染色40 min，水洗返藍，伊紅染色1 min，脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察囊壁炎癥反應及植骨邊緣溶解情況。200倍鏡下隨機選取4個視野，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算陽性細胞數(shù)量，取均值作為細胞密度。2.4.2 IL-1β、TNF-α含量檢測 取出液氮中樣本，研磨成粉，加入PBS混勻，3000 r／min離心10 min，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀測定吸光度，繪制標準曲線，計算樣本IL-1β、TNF-α含量。

2.4.3 OPG、RANKL mRNA表達檢測 采用Realtime PCR法檢測，預冷研體，-80℃中取出樣本，加液氮研磨為粉狀，采用TRIzol提取總RNA，超微量分光光度計測A260／A280比值，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。采用ABI 7500 Fast進行熒光實時定量PCR，引物由Takara公司合成，β-actin：上游 5′AGGCTGTGTTGTCCCTGTA 3′，下游 5′ATGTCACGCACGATTTCC 3′，產(chǎn)物長度 193 bp；OPG：上游 5′CGAAAGCACCCTGTAGGAA 3′，下游5′TGTCCACCAGAACACTCAGC 3′，產(chǎn)物長度 145 bp；RANKL：上游5′TGGAGAGCGAAGACACAGA3′，下游 5′CAGACTGACTTTATGGGAACC 3′，產(chǎn)物長度250 bp。 反應體系：（2×）SYBR Premix Ex Taq 10 μL，（50×）ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，（10 μM）PCR Forward Primer 0.4 μL， （10 μM）PCR Reverse Primer 0.4 μL，cDNA 模板 2 μL，滅菌水 6.8 μL。 反應條件：95 ℃，30 s預變性；95 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，72℃ 15 s，共 40個循環(huán)。β-actin為內(nèi)參基因，測定目標基因Ct值，以對照組相對表達量為1，2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析；非正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 HE染色 HE染色顯示對照組（圖1A）植入顱骨片較完整，骨片表面未見明顯骨吸收，囊壁組織與骨片貼合欠佳，囊壁組織炎性反應輕，以成纖維細胞為主，可見少量的炎癥細胞；模型組（圖1B）骨片表面可見明顯骨吸收，植骨溶解凹陷，囊壁組織與骨片貼合較緊，囊壁增厚，可見明顯炎癥細胞浸潤；健骨顆粒組（圖1C）骨片表面可見骨吸收陷窩，植骨溶解程度、囊壁厚度、炎癥細胞浸潤較模型組低。

3.2 3組干預后IL-1β、TNF-α含量比較 見表1。

3.3 3組干預后 OPG、RANKL mRNA表達比較見表2。

4 討 論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體磨損顆粒誘發(fā)炎性反應，單核巨噬細胞增多。單核巨噬細胞可作為破骨細胞前體分化為破骨細胞，炎癥細胞浸潤釋放多種炎癥因子， 如 IL-1β、IL-6、TNF-α、M-CSF、PGE2等［7-8］，是強大的骨吸收誘導劑，可增加破骨細胞的活性。破骨細胞是體內(nèi)唯一具有骨吸收、骨溶解作用的細胞，其數(shù)量的增加和活性的增強引起假體周圍骨溶解，使假體與骨之間空隙增大，造成假體松動。

圖1 植骨囊壁的HE染色圖（×50）

表2 3 組干預后 IL-1β、TNF-α 含量比較（x±s）pg／mL

表3 3組干預后OPG、RANKL mRNA表達比較（x±s）

健骨顆粒以“腎主骨，生髓”“補先后天”理論為指導，選取煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、淮山藥等組方而成，旨在補腎健脾、強筋壯骨。藥理研究表明：煅狗骨可促進骨基質(zhì)、新骨形成［9］；淫羊藿苷可抑制RAW264.7向破骨細胞分化及骨吸收活性［10］，淫羊藿苷、淫羊藿黃酮類促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞增殖分化［11-12］；山茱萸總苷可增加骨小梁活性成骨細胞表達，促進骨髓基質(zhì)干細胞增殖，提高去勢大鼠骨小梁面積［13-14］；黨參炔苷可促進雌性大鼠卵巢顆粒細胞增殖分泌雌二醇［15］。OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)是參與骨溶解的核心信號通路，假體旁界膜中存在一個完整的OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)，磨損顆粒促使OPG／RANKL比值失衡，從而使假體周圍骨動態(tài)失衡，骨吸收活性增強。

本研究中，通過鈦顆粒誘導大鼠建立骨溶解模型，采用載體實驗探討健骨顆粒對鈦顆粒誘導的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)相關(guān)因子的影響，研究結(jié)果顯示：鈦顆?？纱碳ぶ补菤饽抑車M織的炎癥細胞浸潤、新生血管增生和滲出，炎性反應明顯，引起破骨細胞分化成熟，植入顱骨片邊緣骨溶解顯著，與臨床人工關(guān)節(jié)無菌性松動相似，是關(guān)節(jié)置換術(shù)中晚期失敗的主要原因。健骨顆粒可降低血清炎癥因子表達水平，減少植骨氣囊的炎癥細胞浸潤，一定程度上減輕炎性反應程度，并調(diào)控OPG／RANKL比值，抑制破骨細胞活性，減少顱骨片邊緣骨吸收陷窩，提示健骨顆粒對于假體周圍骨溶解有潛在防治作用。

綜上所述，健骨顆?？捎行Ы档脱装Y反應程度，調(diào)控OPG／RANKL比值，抑制破骨細胞活性，可能是其防治人工假體松動的作用機制之一，為其臨床用藥提供實驗基礎(chǔ)。

［1］ INACIO M C，AKE C F，PAXTON E W，et al.Sex and risk of hip implant failure：assessing total hip arthroplasty outcomes in the United States ［J］.JAMA Intern Med，2013，173（6）：435-441.

［2］ GOODMAN S B，GIBON E，PAJARINEN J，et al.Novel biological strategies for treatment of wear particle-induced periprosthetic osteolysis of orthopaedic implants for joint replacement ［J］.J R Soc Interface，2014，11（93）：20130962.

［3］ 元宇，郭健民，鄒軍.OPG／RANKL／RANK信號通路在運動與骨免疫學中的研究進展［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2015，21（8）：1005-1010.

［4］ 林海鳴，林燕萍，吳銀生.健骨顆粒含藥血清對成骨樣細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響［J］.福建中醫(yī)藥大學學報，2012，22（1）：19-21.

［5］ 丁懷利，吳銀生，林煜，等.大鼠成骨細胞RANKL-OPG mRNA表達的增齡性變化及淫羊藿甙的干預作用［J］.中醫(yī)正骨，2010，22（4）：7-10.

［6］ 陳德勝，李燕，郭鳳英，等.鈦顆粒誘導小鼠植骨氣囊骨溶解模型的構(gòu)建［J］.寧夏醫(yī)科大學學報，2016，38（11）：1228-1231.

［7］ 夏琳.TNF-α對RANKL體外誘導破骨細胞分化的促進作用及其機制探討［D］.濟南：山東大學，2013.

［8］ 邱奕雁，朱峰，藍濤，等.IL-6，IL-1β及 TNF-α與大鼠骨質(zhì)疏松形成的關(guān)系［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2016，16（18）：3448-3451.

［9］ 林燕萍，王和鳴，陳奕權(quán)，等.煅狗骨對實驗性骨折愈合作用的組織學和組織化學研究［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，1991，7（6）：4-9.

［10］李偉娟，謝保平，石麗穎，等.從ERα／RANK通路探討淫羊藿苷抑制破骨細胞分化作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2017，23（7）：121-126.

［11］曾建春，曾意榮，樊粵光，等.淫羊藿甙誘導MSCs向成骨細胞分化過程中對Wnt信號通路的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2014，31（4）：607-611，678.

［12］許靜，張晶晶，郭非非，等.淫羊藿黃酮類主要成分促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞增殖分化作用及機制的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2017，23（14）：113-120.

［13］王艷，宋春靜，孫秀巖，等.山茱萸總苷及其含藥血清對MSCs增殖的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2013，32（2）：101-104.

［14］李晶，武峻艷，王慧明，等.山茱萸總苷對去勢大鼠骨組織形態(tài)學影響的實驗研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2010，44（1）：69-72.

［15］唐曉靜，江濤，徐斯凡.黨參炔苷對雌性大鼠卵巢顆粒細胞增殖分化的影響及其作用機制［J］.生殖與避孕，2015，35（9）：587-592，639.