基于WNT／β-catenin通路研究石斛合劑對(duì)衰老糖尿病大鼠脂代謝的調(diào)控機(jī)制

劉 赟 ，林心君 ，施 紅 ，許 茜

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能教學(xué)中心，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

目前，全世界糖尿病患者日趨增多，據(jù)世界衛(wèi)生組織估量，至2050年，全球糖尿病患者將超過3億。糖尿病患者存在脂代謝紊亂的情況，而肝臟脂代謝的異常又能促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)展。有研究表明，慢性游離脂肪酸的升高和胰島細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的增加能促使胰島β細(xì)胞凋亡；高脂血癥又使糖尿病患者心血管疾病的發(fā)病率增加，因此在治療糖尿病的同時(shí)要積極降低患者的血脂［1］。石斛合劑具有滋陰、清熱、益氣、活血、瀉濁等功效，通過以往的研究發(fā)現(xiàn)，該合劑能夠降低糖尿病大鼠血糖，改善血脂，并且其作用顯著優(yōu)于西藥二甲雙胍［2-3］。本研究通過對(duì)衰老糖尿病大鼠肝臟基因芯片的分析，探討石斛合劑調(diào)控衰老糖尿病大鼠肝臟脂代謝的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只12周齡SPF級(jí)雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 石斛合劑1、2號(hào)方：石斛、黃芪、五味子、丹參等，3號(hào)方：茵陳、大黃、梔子、五味子等。鹽酸二甲雙胍緩釋片（廣東省藥物研究所制藥廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 烏拉坦（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20100310）；基因表達(dá)譜雜交試劑盒（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#5188-5242）；基因表達(dá)譜洗片試劑盒（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#5188-5327）；兔抗鼠-β-catenin多克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)公司）；基因芯片掃描儀（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#G2565CA）；7180 型自動(dòng)生化分析儀（日立公司）；FJ2008PS型γ放射免疫計(jì)數(shù)器（西安核儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液制備 石斛合劑1、2、3號(hào)方分別按生藥含量為2.0 g／mL滅菌后100 mL分裝一瓶，分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 建立模型 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，根據(jù)課題組前期工作研究［2］，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只和造模組40只，分別喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料和高脂高糖飼料12個(gè)月后，造模組予腹腔注射低劑量的鏈脲佐菌素（STZ）20 mg／kg，注射 1次，3 d之后篩選出隨機(jī)血糖≥16.7 mmol／L的衰老糖尿病模型大鼠32只，隨機(jī)分為模型組10只、二甲雙胍組10只、石斛合劑組12只。

2.3 干預(yù) 石斛合劑組按 12 g／（kg·d）予石斛合劑灌胃，第1～5天予石斛合劑1號(hào)方灌胃，第6～10天予石斛合劑2號(hào)方灌胃，第11～12天予石斛合劑3號(hào)方灌胃，此為1個(gè)療程，共灌胃2個(gè)療程；二甲雙胍組按 50 mg／（kg·d）予二甲雙胍灌胃；正常對(duì)照組和模型組予等量生理鹽水灌胃。每日1次，共干預(yù)24 d。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 生化指標(biāo)檢測 動(dòng)物處死后取腹主動(dòng)脈血，應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀檢測甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和膽固醇（CHOL）。

2.4.2 HE染色 取肝臟切片常規(guī)脫臘，入水。100%酒精脫洗5 min 2次，95%酒精、80%酒精各脫洗5 min，自來水充分沖洗5 min。蘇木素浸泡5 min，自來水沖洗；1%鹽酸分化，自來水沖洗；伊紅染液中染色2 min；依次于70%、80%、90%、95%酒精梯度酒精脫水各2 min，100%酒精10 min脫水2次，二甲苯透明后，中性樹膠封片。

2.4.3 免疫組化檢測肝臟β-鏈蛋白（β-catenin）表達(dá)量 包埋、切片、脫蠟和水化后，用自來水沖洗。對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)，并用 PBS沖洗3次，除去PBS液。每張片加1滴或50 μL 3%過氧化氫，在室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，各3 min。每張切片加1滴或50 μL非免疫山羊血清，室溫下孵育10 min后直接甩去液體。每張切片加50 μL的第一抗體，室溫下孵育60 min，PBS沖洗 3次，各3～5 min。除去 PBS液，每張切片加 50 μL即用MaxVisionTM試劑，室溫下孵育 15 min，PBS沖洗 3次，各3 min。除去PBS液，每張切片加100 μL新鮮配制的DAB顯色液，作用5 min，顯微鏡下觀察。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。設(shè)空白二甲雙胍組，用PBS液沖洗，不加1抗，其余各步驟與其他切片相同。

2.4.4 基因芯片檢測 取肝臟組織交由上海伯豪生物工程有限公司進(jìn)行Angilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片測試，芯片名稱為：Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarray（4×44K）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。基因芯片采用上海伯豪生物技術(shù)公司SAS在線分析系統(tǒng)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，計(jì)算差異倍數(shù)值（fold change，F(xiàn)C）。

3 結(jié) 果

3.1 4 組大鼠血清 HDL、LDL、TG、CHOL 水平比較見表1。

表1 4 組大鼠血清 HDL、LDL、TG、CHOL 水平比較（x±s）mmol／L

3.2 肝臟HE染色 模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞胞漿疏松化，有些則呈氣球樣變，炎細(xì)胞浸潤明顯，纖維組織增生，包繞匯管區(qū)；二甲雙胍組和石斛合劑組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)稍紊亂，氣球樣變、炎細(xì)胞浸潤較模型組明顯減少。見圖1。

圖1 4組大鼠肝臟HE染色圖（×40）

3.3 免疫組化檢測β-catenin 模型組β-catenin高表達(dá)，并且可見部分細(xì)胞核出現(xiàn)表達(dá)，大部分細(xì)胞核移位，脂肪變性較嚴(yán)重；二甲雙胍組有部分 βcatenin表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；但細(xì)胞核未見β-catenin表達(dá)，部分細(xì)胞核移位；石斛合劑組β-catenin表達(dá)量、核移位、脂肪變性少于二甲雙胍組。見圖2、表2。

圖2 4組大鼠肝臟β-catenin免疫組化圖（×400）

表2 4組大鼠肝臟β-catenin表達(dá)比較（x±s）

3.4 脂代謝相關(guān)基因芯片結(jié)果 見表3、4。判定標(biāo)準(zhǔn)：FC值≥2的基因?yàn)楸磉_(dá)顯著上調(diào)基因，F(xiàn)C值≤0.5為表達(dá)顯著下調(diào)基因。

4 討 論

2型糖尿病的患者多數(shù)存在脂代謝紊亂，而高血糖和高血脂導(dǎo)致糖尿病的并發(fā)癥，例如動(dòng)脈粥樣硬化等，而動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者致死的首要原因［4］，長期的高血脂能降低機(jī)體各組織對(duì)胰島素的敏感性。因此，調(diào)節(jié)糖尿病脂代謝的紊亂相當(dāng)重要。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為糖尿病的病位在脾（胃）、肝、腎，多為虛實(shí)夾雜，即以陰虛或者氣陰兩虛為本，痰濁血瘀為標(biāo)。在疾病初期多以標(biāo)實(shí)為主，情志失調(diào)，繼而痰濁化熱傷陰；后期以本虛為主，且多為陰陽兩虛，并兼有痰濁、瘀血，而痰濁和瘀血又相互影響，耗傷氣血、損傷臟腑［5］。 林蘭教授［6］認(rèn)為糖尿病分為三型：即陰虛熱盛、氣陰兩虛、陰陽兩虛，分別代表著糖尿病病程的早、中、晚三個(gè)時(shí)期，基本證候?yàn)闅怅巸商?，兼有血瘀，而陰虛則貫穿整個(gè)糖尿病的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)臨床2型糖尿病本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)特點(diǎn)，確立以標(biāo)本兼治、扶正祛邪為主的治療原則，先采用益氣、滋陰、活血，兼以生津、清熱的1、2號(hào)方，再佐以利濕泄?jié)岬?號(hào)方，扶正與祛邪分而治之，以免功效互抵，并注意在祛邪時(shí)不傷正。本研究通過對(duì)衰老糖尿病大鼠肝臟組織基因芯片的分析，旨在探索石斛合劑治療糖尿病，特別是調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的相關(guān)通路，為石斛合劑治療糖尿病的機(jī)制研究提供方向。

表3 石斛合劑組對(duì)比模型組表達(dá)明顯下調(diào)的基因

表4 模型組明顯下調(diào)或上調(diào)，經(jīng)石斛合劑治療后恢復(fù)正常的基因

通過對(duì)血清學(xué)的檢查發(fā)現(xiàn)經(jīng)石斛合劑治療后衰老糖尿病大鼠血清LDL、TG、CHOL水平顯著降低，HDL水平顯著升高?；蛐酒瑑蓛蓪?duì)比發(fā)現(xiàn)，石斛合劑組對(duì)比模型組叉頭框蛋白Q1（forkhead box Q1，F(xiàn)OXQ1）、WNT1 誘導(dǎo)信號(hào)通道蛋白 2（WNT1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2）基因表達(dá)顯著下調(diào)；通過石斛合劑的治療，模型組對(duì)比正常對(duì)照組下調(diào)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-5（low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）、無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員7A（wingless-type MMTV integration site family，member 7A，WNT7A）基因恢復(fù)正常表達(dá)，上調(diào)的WISP2基因恢復(fù)正常表達(dá)。FOXQ1能參與調(diào)節(jié)WNT／β-catenin信號(hào)通路，有研究表明，在肝癌的患者中FOXQ1呈高表達(dá)，而當(dāng)FOXQ1沉默時(shí)可以抑制肝癌細(xì)胞血管的生成［7］。當(dāng)WISP2和其他WNT激活的標(biāo)志物表達(dá)增加時(shí)，能增加肥胖、內(nèi)臟脂肪積累和胰島素抵抗［8］。WNT7A屬于WNT家族，能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［9］。LRP5屬于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白，是WNT經(jīng)典通路中的一個(gè)受體，其能參與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吸收。WNT通路中的主要組成有配體如WNT家族分子、跨膜受體如LRP5、胞漿調(diào)節(jié)蛋白β-catenin等。β-catenin在WNT經(jīng)典通路中有著相當(dāng)重要的作用，有研究表明，WNT／βcatenin通路的活化不僅能增加病毒性肝炎患者病毒的表達(dá)，還能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，使肝癌的預(yù)后不良［10-12］。通過基因芯片的研究發(fā)現(xiàn)石斛合劑能使衰老糖尿病大鼠LRP5、WNT7A基因恢復(fù)到正常水平，將衰老糖尿病大鼠顯著上調(diào)的WISP2基因恢復(fù)到正常水平，提示石斛合劑可能主要是通過“糾偏”達(dá)到調(diào)控衰老糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝的作用；通過石斛合劑的治療能夠降低FOXQ1基因表達(dá)，提示石斛合劑可能具有抑制衰老糖尿病大鼠肝癌發(fā)生的作用。通過對(duì)免疫組化結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，石斛合劑組、二甲雙胍組β-catenin的表達(dá)量均顯著低于模型組，提示石斛合劑可能是通過調(diào)節(jié)WNT／β-catenin信號(hào)通路起到抑制肝臟癌變、減少內(nèi)臟脂肪積累等達(dá)到調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的作用。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)石斛合劑能通過“糾偏”達(dá)到調(diào)節(jié)WNT／β-catenin信號(hào)通路的作用。通過對(duì)已知基因的研究發(fā)現(xiàn)，石斛合劑能通過控制脂肪生成，增加脂肪酸的β氧化，促進(jìn)脂肪分解及脂肪酸的運(yùn)輸，通過調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路，從而降低血清LDL、TG、CHOL水平，升高 HDL水平，起到保護(hù)肝臟、減少肥胖、減輕內(nèi)臟脂肪積累、降低胰島素抵抗的作用，從而對(duì)糖尿病大鼠脂代謝起到調(diào)控的作用。

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