負壓創(chuàng)面療法與常規(guī)無菌紗布對感染創(chuàng)面愈合影響的比較

王國旗，唐佩福

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

感染是導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合的重要因素之一[1-4]。由于感染等因素導(dǎo)致的創(chuàng)面難以愈合困擾著相當(dāng)比例的人群。近年來眾多研究相繼報道負壓創(chuàng)面療法(negative pressure wound therapy，NPWT)在感染性創(chuàng)面中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其可以有效減輕創(chuàng)面感染程度，加速創(chuàng)面愈合[5-9]。課題組前期對負壓創(chuàng)面療法治療金黃色葡萄球菌感染創(chuàng)面進行了研究，發(fā)現(xiàn)其可以減少創(chuàng)面細菌數(shù)量、促進創(chuàng)面愈合[10-12]。本研究對負壓創(chuàng)面療法治療的銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面的愈合程度進行定量分析，并與傳統(tǒng)無菌紗布治療進行對比，以探索負壓創(chuàng)面療法治療感染創(chuàng)面的優(yōu)勢。

材料和方法

1 實驗動物 選取巴馬香豬18只，購自解放軍醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動物中心，體質(zhì)量15 kg左右，雌性，術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會審批。

2 銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面的模型建立 常規(guī)麻醉、瑪貝拉脫毛膏脫毛、消毒，然后在巴馬香豬背部建立一個直徑50 mm深達肌肉層的軟組織創(chuàng)面，去除肌肉腱膜，充分止血后接種0.5 ml(總菌量約為5×107CFU)銅綠假單胞菌菌液，涂抹均勻，半透明膜敷料覆蓋24 h，以確保細菌的穩(wěn)定黏附和定植。

3 分組及處理 半透明膜敷料覆蓋24 h后(建模成功，0 d)將巴馬香豬隨機分為負壓創(chuàng)面療法組和無菌紗布治療組并分別進行治療。每天密切觀察敷料變化情況，每2 d更換敷料1次。負壓創(chuàng)面療法組敷料購自武漢維斯第公司，對照組紗布為臨床常用無菌紗布。整個治療過程中兩組未采用抗生素等其他治療措施。分別于0 d、4 d、8 d、12 d、16 d定量檢測創(chuàng)面大小，充分麻醉后切取創(chuàng)面肌肉組織2塊(每4天取材1次)，大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，重量不低于200 mg，取材時注意標(biāo)記創(chuàng)面?zhèn)取Ｓ糜谏L因子表達水平檢測的標(biāo)本保存于-80℃冰箱中，用于組織病理學(xué)檢測的標(biāo)本保存于10%中性甲醛溶液中。

4 熒光定量PCR檢測VEGF和TGF-β1表達首先提取總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后按照熒光定量PCR說明書分別加入相應(yīng)試劑、引物、提取的總RNA樣品等進行PCR反應(yīng)。熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理方法：變化的倍數(shù)(fold change)=2-ΔΔCT；ΔΔCT=(CT靶基因-CT內(nèi)參)實驗組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)對照組。

圖 1 軟組織創(chuàng)面外相 (0 d代表建模成功， 4 d代表治療的第4天， 后面的以此類推)Fig. 1 Appearance of wounds (0 d represents the successful establishment of model and 4 d means the 4th day of treatment, so on and so forth)

5 免疫組化染色 觀察新生毛細血管抗CD31抗體購自英國Abcam公司。首先將標(biāo)本制作成蠟塊，進行組織切片。然后依據(jù)說明書經(jīng)過脫蠟、檸檬酸-檸檬酸鈉修復(fù)、加胎牛血清、加一抗、過夜、加入二抗、沖洗、終止顯色、封片等步驟進行染色。采用Image Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件對免疫組化切片進行分析，巴馬香豬標(biāo)本檢測參數(shù)包括毛細血管面積。其中毛細血管面積檢測：在同一標(biāo)本中隨機選取5個視野，應(yīng)用軟件測算每個視野中毛細血管的面積(Area)，取平均值。

6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用兩因素重復(fù)測量方差分析對各定量指標(biāo)進行比較，事后檢驗采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 創(chuàng)面外觀及覆蓋情況 在治療第4天時對照組創(chuàng)面較為污穢并且存在大量膿樣物，實驗組盡管存在少量污物，但已經(jīng)可見肉芽組織生長。治療第8天，對照組創(chuàng)面可見黑色痂，創(chuàng)面中心可見新生肉芽組織，此時實驗組依然可見膿性物質(zhì)，而且主要集中在創(chuàng)面的邊緣，但創(chuàng)面中心明顯富含新鮮肉芽組織。治療第12天，對照組創(chuàng)面黑痂中心發(fā)紅，而實驗組創(chuàng)面新生肉芽組織豐富，肉眼已經(jīng)看不到膿性物質(zhì)，創(chuàng)面明顯小于對照組。治療第16天，實驗組創(chuàng)面已與周圍組織平齊，缺損組織已由肉芽組織填充，已經(jīng)不再需要負壓吸引，創(chuàng)面依然小于對照組(P＜0.01)。負壓創(chuàng)面療法組和對照組創(chuàng)面完全愈合時間分別為(18.8±2.0) d和(23.5±2.7) d (P＜0.01)。創(chuàng)面愈合情況及直徑大小結(jié)果見圖1和圖2。

2 肉芽組織厚度分析 在治療的第4天顯微鏡下兩組均已出現(xiàn)肉芽組織，而負壓創(chuàng)面療法肉芽組織厚度明顯大于對照組(P＜0.01)。隨著治療時間的延長，兩組創(chuàng)面肉芽組織厚度均逐漸升高，但實驗組肉芽組織厚度明顯高于對照組(P均＜0.01)。肉芽組織厚度示意圖及隨治療時間變化見圖3。圖 2 軟組織創(chuàng)面直徑大小隨治療時間延長的變化情況(aP＜0.01)Fig. 2 Diameter of wounds changes over time (aP＜0.01)

圖 3 兩組新生肉芽組織厚度比較(aP＜0.01, vs對照組)Fig. 3 Comparison of epithelial tissue thickness between two groups(aP＜0.01, vs control group)

圖 4 兩組VEGF表達對比(aP＜0.05，bP＜0.01, vs對照組)Fig. 4 Comparison of expression level of VEGF between two groups(aP＜0.05, bP＜0.01, vs control group)

3 生長因子表達比較 治療第4天、第8天、第12天和第16天負壓創(chuàng)面療法組VEGF表達水平均高于對照組(P＜0.05)，見圖4。治療的第8天、第12天和第16天負壓創(chuàng)面療法組TGF-β1表達水平明顯高于對照組(P＜0.01)。見圖5。

4 新生毛細血管定量分析 以建模前軟組織內(nèi)毛細血管面積為參考(此時血管面默認為“1”)，從治療的第4天開始兩組新生毛細血管面積均逐漸增加，在治療的第4、8、12、16天負壓創(chuàng)面療法血管面積明顯大于對照組(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。見圖6。

圖 5 兩組TGF-β1表達水平對比(aP＜0.01, vs對照組)Fig. 5 Comparison of expression level of TGF-β1 between two groups (aP＜0.01, vs control group)

圖 6 兩組新生毛細血管面積對比(aP＜0.05，bP＜0.01, vs對照組)Fig. 6 Comparison of area of newborn capillaries (Fold change,aP＜0.05，bP＜0.01, vs control group)

討 論

感染創(chuàng)面的修復(fù)過程主要分為3個階段，即損傷后炎癥反應(yīng)階段、肉芽組織形成階段、瘢痕形成階段。如果某一階段時間延長，那么整個愈合時間也會延長，如感染持續(xù)存在就會導(dǎo)致局部持續(xù)性的炎癥反應(yīng)，進而延長這一階段的時間。要治愈軟組織感染，一方面要去除破壞軟組織的不利因素，這些因素包括細菌、生物膜、毒素、過度表達的細胞因子等，另一方面要促進創(chuàng)面局部血液供應(yīng)、形成新鮮肉芽組織給植皮或封閉創(chuàng)面等提供有利條件。臨床上實現(xiàn)上述目的通常采用外科清創(chuàng)、局部應(yīng)用抗菌劑、無菌紗布覆蓋等措施[13-15]。但通常情況下外科清創(chuàng)會清除較多的正常軟組織以減少創(chuàng)面細菌及生物膜的殘留，這種情況可能不利于愈合。因此，這種方法更傾向于首先消滅細菌，之后處理愈合問題。負壓創(chuàng)面療法是處理開放合并軟組織感染創(chuàng)面的重要方法之一，目前臨床上應(yīng)用廣泛[16-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)負壓創(chuàng)面療法治療下銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面與對照組相比更清潔，但創(chuàng)面仍有膿性分泌物，直到治療的第8天仍可見。盡管有感染的存在，負壓創(chuàng)面療法組創(chuàng)面隨著治療時間延長明顯縮小，其在治療的第8天開始明顯小于對照組。肉芽組織厚度分析顯示，從治療的第4天開始負壓創(chuàng)面療法組創(chuàng)面新生肉芽組織厚度明顯厚于對照組。而兩組在治療的第4天時創(chuàng)面均有膿性物質(zhì)，對照組相對明顯。這說明負壓創(chuàng)面療法治療時，盡管創(chuàng)面依然存在感染，但已經(jīng)開始形成新鮮的肉芽組織。這可能得益于負壓創(chuàng)面療法在負壓吸引下海綿孔對創(chuàng)面進行的物理牽拉作用。因此，負壓創(chuàng)面療法治療時肉芽組織形成較多可能是其促進愈合的重要機制之一。

與常規(guī)無菌紗布治療相比，負壓創(chuàng)面療法治療時創(chuàng)面VEGF表達水平明顯增高，說明負壓創(chuàng)面療法可以去除銅綠假單胞菌生物膜對創(chuàng)面VEGF的抑制，為VEGF促進局部新生組織內(nèi)血管的形成提供條件，間接地加強了創(chuàng)面細菌的清理；而新生毛細血管定量分析結(jié)果進一步證實了負壓創(chuàng)面療法的作用。TGF-β1表達水平增加，促進創(chuàng)面的表皮修復(fù)，加速創(chuàng)面的覆蓋，而負壓創(chuàng)面療法由于負壓作用自身帶有組織牽拉的作用，也可以刺激肉芽的生長及表皮爬行。

本研究的不足：未對創(chuàng)面細菌變化進行定量分析；未對負壓創(chuàng)面療法治療下創(chuàng)面免疫表達變化進行分析。

綜上，負壓創(chuàng)面療法是處理軟組織感染創(chuàng)面的有效方法之一，與常規(guī)無菌紗布覆蓋治療相比，負壓創(chuàng)面療法可有效促進開放傷軟組織感染創(chuàng)面新生肉芽組織的形成，加快創(chuàng)面愈合。

1 Hurlow J， Blanz E， Gaddy JA. Clinical investigation of biofilm in non-healing wounds by high resolution microscopy techniques［J］.J Wound Care， 2016， 25（Suppl 9）： S11-S22.

2 Moore MF. Biofilms， Their Role and Treatment Options in the Chronic Non-Healing Wound［J/OL］. http：//surgicaltechnology.com/31-Orthopaedic-Surgery.htm#934.

3 Snyder RJ， Bohn G， Hanft J， et al. Wound Biofilm ： Current Perspectives and Strategies on Biofilm Disruption and Treatment［J］.Wounds， 2017， 29（6）： S1-S17.

4 Chen S， Li R， Cheng C， et al. Pseudomonas aeruginosa infection alters the macrophage phenotype switching process during wound healing in diabetic mice［J/OL］. https：//onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cbin.10955.

5 Liu Y， Zhou Q， Wang Y， et al. Negative pressure wound therapy decreases mortality in a murine model of burn-wound sepsis involving Pseudomonas aeruginosa infection［J］. PLoS ONE， 2014， 9（2）：e90494.

6 Davis K， Bills J， Barker J， et al. Simultaneous irrigation and negative pressure wound therapy enhances wound healing and reduces wound bioburden in a porcine model［J］. Wound Repair Regen， 2013， 21（6）： 869-875.

7 Lalliss SJ， Stinner DJ， Waterman SM， et al. Negative pressure wound therapy reduces pseudomonas wound contamination more than Staphylococcus aureus［J］. J Orthop Trauma， 2010， 24（9）：598-602.

8 Li T， Zhang L， Han LI， et al. Early application of negative pressure wound therapy to acute wounds contaminated with Staphylococcus aureus： An effective approach to preventing biofilm formation［J］.Exp Ther Med， 2016， 11（3）： 769-776.

9 Liu D， Zhang L， Li T， et al. Negative-pressure wound therapy enhances local inflammatory responses in acute infected soft-tissue wound［J］. Cell Biochem Biophys， 2014， 70（1）： 539-547.

10 劉道宏. 負壓創(chuàng)面療法治療感染性軟組織損傷相關(guān)機制研究［D］. 北京 ： 解放軍醫(yī)學(xué)院， 2014.

11 李曈曈. 負壓治療在急性軟組織創(chuàng)傷感染中的作用與機制研究［D］. 天津 ： 南開大學(xué)， 2016.

12 李志銳. 新型負壓引流沖洗敷料的研發(fā)及其治療感染性軟組織損傷療效的評價［D］. 北京： 解放軍醫(yī)學(xué)院， 2016.

13 Thompson E. Debridement Techniques and Non-Negative Pressure Wound Therapy Wound Management［J］. Vet Clin North Am Small Anim Pract， 2017， 47（6）： 1181-1202.

14 Han G， Ceilley R. Chronic Wound Healing： A Review of Current Management and Treatments［J］. Adv Ther， 2017， 34（3）： 599-610.

15 Bigliardi PL， Alsagoff SAL， El-Kafrawi HY， et al. Povidone iodine in wound healing ： A review of current concepts and practices［J］.Int J Surg， 2017， 44 ： 260-268.

16 Bhandari M， Jeray KJ， Petrisor BA， et al. A Trial of Wound Irrigation in the Initial Management of Open Fracture Wounds［J］. N Engl J Med， 2015， 373（27）： 2629-2641.

17 Bellosta R， Luzzani L， Bontempi F， et al. Negative pressure wound therapy （NPWT） treatment of total supra-aortic debranching graft infection［J］. Arch Med Sci， 2018， 14（2）： 466-469.

18 Tamir E， Finestone AS， Wiser I， et al. Outpatient Negative-Pressure Wound Therapy Following Surgical Debridement：Results and Complications［J/OL］. http：//insights.ovid.com/pubmed?pmid=29649067.