穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記對(duì)甲氧基苯甲酸的合成

王 偉，杜曉寧，徐建飛，雷 雯

(上?；ぱ芯吭河邢薰?上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062)

對(duì)甲氧基苯甲酸(p-methoxybenzoic acid)又稱對(duì)茴香酸、大茴香酸。穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記對(duì)甲氧基苯甲酸是防腐劑、香料及藥物等穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)試劑的重要中間體。穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)試劑在食品安全檢測(cè)[1-2]、新藥篩選和復(fù)雜基質(zhì)中相關(guān)代謝物的定量分析中越來(lái)越受到關(guān)注[3-6]。如合成13C或D標(biāo)記3-氨基-4-甲氧基苯甲酸及對(duì)甲氧基苯甲酰氯，同時(shí)也可作為13C或D標(biāo)記茴拉西坦、乙胺磺膚酮等的醫(yī)藥中間體。

天然豐度對(duì)甲氧基苯甲酸的合成主要采用硫酸二甲酯與對(duì)羥基苯甲酸或?qū)追訛樵?，在堿性條件下通過(guò)甲基化反應(yīng)獲得[1-2]，該方法因穩(wěn)定同位素標(biāo)記硫酸二甲酯合成難度較大而不適合穩(wěn)定同位素標(biāo)記對(duì)甲氧基苯甲酸的合成；也有研究者以對(duì)甲苯酚和碘甲烷為原料，利用相轉(zhuǎn)移催化法制備對(duì)甲氧基苯甲酸[3]，該方法反應(yīng)條件苛刻、后處理難度大。Wang等[4]以CD3I和對(duì)羥基苯甲酸為原料，經(jīng)雙甲基化、脫甲氧基(-CD3)后得到對(duì)甲氧基苯甲酸-D3，該工藝需要過(guò)量2倍(2 eq)的穩(wěn)定同位素原料，成本較高。Jemal等[5]以1.2 eq的CD3I和對(duì)羥基苯甲酸為原料，通過(guò)控制加入堿的量，選擇性合成對(duì)甲氧基苯甲酸-D3，但該工藝得到的產(chǎn)物中同時(shí)含有羥基位甲基化產(chǎn)物和羧基位甲基化產(chǎn)物，普通的純化過(guò)程難以獲得純度較高的對(duì)甲氧基苯甲酸-D3，上述2種工藝過(guò)程中，對(duì)羥基苯甲酸在堿性條件下首先與CD3I反應(yīng)生成對(duì)羥基苯甲酸甲酯-D3，再與過(guò)量的CD3I反應(yīng)生成對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯-D3，最后通過(guò)脫-CD3基團(tuán)生成對(duì)甲氧基苯甲酸-D3，不僅成本較高，而且反應(yīng)過(guò)程易發(fā)生酯交換等副反應(yīng)。

本文以穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記碘甲烷和尼泊金乙酯(對(duì)羥基苯甲酸乙酯)為原料，經(jīng)甲基化、堿解、重結(jié)晶后可得到純度較高的穩(wěn)定同位素標(biāo)記對(duì)甲氧基苯甲酸，該工藝路線簡(jiǎn)便，甲氧基選擇性高，同位素利用率高，適于穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記對(duì)甲氧基苯甲酸的合成。

1 主要儀器與試劑

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪高科儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；島津2020型液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS)：日本島津公司；精科WRS-2C型熔點(diǎn)儀：上海精密儀器儀表有限公司；JNM-ECZR核磁共振儀：日本電子株式會(huì)社(JEOL)。

碘甲烷-13C(13CH3I)：13C同位素豐度>99%，上?；ぱ芯吭河邢薰井a(chǎn)品；碘甲烷-D3(CD3I)：D同位素豐度>98.5%，上海化工研究院有限公司產(chǎn)品；碘甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、尼泊金乙酯、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、無(wú)水硫酸鎂等試劑均為市售分析純或化學(xué)純：國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，使用前均未進(jìn)一步純化。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 合成條件的選擇

采用單因素實(shí)驗(yàn)確定了穩(wěn)定同位素標(biāo)記對(duì)甲氧基苯甲酸合成工藝的反應(yīng)溫度、物料摩爾比及反應(yīng)時(shí)間。進(jìn)行工藝條件篩選時(shí)，為節(jié)省成本，采用的同位素原料實(shí)際為天然豐度原料。在后續(xù)用穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記碘甲烷代替天然豐度碘甲烷時(shí)，對(duì)反應(yīng)的收率和同位素原料利用率的趨勢(shì)沒(méi)有影響。

2.2 對(duì)甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成

對(duì)甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成路線示于圖1。

圖1 對(duì)甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成路線Fig.1 Synthetic route of [13C/D3] p-methoxybenzoic acid

在帶有磁力攪拌和溫度計(jì)的250 mL三口燒瓶中，N2保護(hù)下加入4.15 g(25 mmol)尼泊金乙酯、6.90 g(50 mmol)K2CO3、4.08 g(28.75 mmol)13CH3I，及50 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。磁力攪拌下將反應(yīng)液通過(guò)油浴鍋升溫至80 ℃，回流反應(yīng)6 h，趁熱過(guò)濾除去不溶物。向?yàn)V液中加入50 mL乙酸乙酯及20 mL鹽酸，萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鎂干燥，旋蒸濃縮后的產(chǎn)物可直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

在帶有磁力攪拌和溫度計(jì)的250 mL三口燒瓶中，N2保護(hù)下加入上一步反應(yīng)產(chǎn)物、40 mL NaOH溶液，及10 mL無(wú)水乙醇，加熱回流2 h，冰水浴下，用2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至1，析出白色固體，乙醇-水重結(jié)晶后得白色結(jié)晶產(chǎn)物，即為對(duì)甲氧基苯甲酸產(chǎn)品。產(chǎn)品經(jīng)干燥、稱重后得3.47 g白色結(jié)晶，收率為91.23%，純度為99.0%，碘甲烷利用率(同位素原料利用率)為79.33%，熔點(diǎn)為185.5～187.4 ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 合成條件

3.1.1反應(yīng)溫度

固定碘甲烷與尼泊金乙酯的摩爾比為n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1，反應(yīng)時(shí)間為6 h，考察反應(yīng)溫度對(duì)同位素原料(碘甲烷)利用率的影響，結(jié)果示于圖2。由圖2可知，反應(yīng)溫度的變化對(duì)同位素原料利用率的影響較大，當(dāng)反應(yīng)溫度低于80 ℃時(shí)，隨反應(yīng)溫度升高，原料利用率逐漸升高；當(dāng)反應(yīng)溫度高于80 ℃時(shí)，易發(fā)生酯交換等副反應(yīng)，使原料利用率降低。因此，適合的反應(yīng)溫度為80 ℃。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)同位素原料利用率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the utilization of isotope material

3.1.2物料摩爾比

由于穩(wěn)定同位素原料價(jià)格昂貴，為降低產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)成本，理論上應(yīng)使非同位素原料過(guò)量，但該反應(yīng)過(guò)程中，若使尼泊金乙酯過(guò)量，則容易發(fā)生酯交換副反應(yīng)，造成收率降低。因此，本文擬使碘甲烷過(guò)量，考察物料摩爾比對(duì)產(chǎn)物收率及碘甲烷利用率的影響。

固定反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時(shí)間為6 h，考察物料摩爾比n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)對(duì)產(chǎn)物收率及同位素原料利用率的影響，結(jié)果示于圖3。

由圖3數(shù)據(jù)可知，當(dāng)n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1∶1時(shí)，反應(yīng)收率及碘甲烷利用率均為65%，隨著碘甲烷加入量的增加，當(dāng)n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)>1.15∶1時(shí)，反應(yīng)收率基本維持不變，但碘甲烷利用率降低。因此，合適的物料摩爾比為n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1。

圖3 物料摩爾比對(duì)產(chǎn)物收率及原料利用率的影響Fig.3 Effect of material mole ratio on product yield and isotope utilization

3.1.3反應(yīng)時(shí)間

固定碘甲烷與尼泊金乙酯的摩爾比為n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1，反應(yīng)溫度為80 ℃，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)同位素原料(碘甲烷)利用率的影響，結(jié)果示于圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)同位素原料利用率的影響Fig.4 Effect of reaction time on the utilization of isotope material

由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，同位素原料利用率提高較快，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于6 h時(shí)，同位素原料利用率有所下降，這可能是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致使副反應(yīng)發(fā)生。因此，合適的反應(yīng)時(shí)間為6 h。

3.2 穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記

在單因素試驗(yàn)優(yōu)化的工藝條件下，用碘甲烷-13C(13CH3I)和碘甲烷-D3(CD3I)分別代替天然豐度碘甲烷，合成了對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C和對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3產(chǎn)品。其中，對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C收率為91.12%，純度為99.1%，13C同位素豐度為99.0%，13C穩(wěn)定同位素原料利用率為79.32%，熔點(diǎn)為186.5～187.8 ℃；對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3收率為90.49%，純度為99.0%，D同位素豐度為98.1%，D穩(wěn)定同位素原料利用率為78.70%，熔點(diǎn)為186.3～188.1 ℃。同位素豐度均未出現(xiàn)明顯稀釋，說(shuō)明該工藝路線可行。

3.3 產(chǎn)品的表征

對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的LC-MS圖譜示于圖5。主峰ESI-MS-：m/z=152[M-H]-，比天然豐度對(duì)甲氧基苯甲酸多1個(gè)質(zhì)量數(shù)，計(jì)算13C同位素豐度為99.0%。

圖5 甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的質(zhì)譜圖Fig.5 MS of [13C] p-methoxybenzoic acid

圖6 甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的質(zhì)譜圖Fig.6 MS of [D3] p-methoxybenzoic acid

對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的LC-MS圖譜示于圖6。主峰ESI-MS-：m/z=154[M-H]-，比天然豐度對(duì)甲氧基苯甲酸多3個(gè)質(zhì)量數(shù)，計(jì)算D同位素豐度為98.1%。

對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的核磁共振(1H NMR)圖譜示于圖7。1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：8.06(2H,d,ph-H),6.94(2H,d,ph-H),3.87(3H,m,Me-H)。

圖7 甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的1H NMRFig.7 1H NMR of [13C] p-methoxybenzoic acid

對(duì)甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的1H NMR圖譜示于圖8。1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：8.07(2H,d,ph-H),6.95(2H,d,ph-H)，與天然豐度對(duì)甲氧基苯甲酸1H NMR相比，無(wú)δ=3.87的位移，說(shuō)明氘同位素取代位置與預(yù)期相同。

圖8 甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的1H NMRFig.8 1H NMR of [D3] p-methoxybenzoic acid

4 結(jié)論

(1) 本文以穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記碘甲烷和尼泊金乙酯為原料，堿性條件下經(jīng)2步反應(yīng)制備得到穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記對(duì)甲氧基苯甲酸，反應(yīng)條件溫和、對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求。

(2) 采用單因素試驗(yàn)對(duì)合成工藝關(guān)鍵步驟進(jìn)行優(yōu)化，得到了適合的反應(yīng)溫度、物料摩爾比、反應(yīng)時(shí)間等工藝條件，產(chǎn)品的收率大于91%，穩(wěn)定同位素原料(CD3I和13CH3I)利用率均大于78%，降低了產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)成本。

(3) 產(chǎn)品經(jīng)LC-MS進(jìn)行純度和同位素豐度分析，經(jīng)1H NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，化學(xué)純度均大于99%，13C同位素豐度為99.0%，D同位素豐度為98.1%，同位素豐度未出現(xiàn)明顯稀釋。

參考文獻(xiàn)：

[1] 杜曉寧,王偉,雷雯. 穩(wěn)定性同位素標(biāo)記試劑的研發(fā)及應(yīng)用展望[J]. 化學(xué)試劑,2015,37(09):769-775+798.

Du Xiaoning, Wang Wei, Lei Wen. The prospect application and development of stable isotope labeling reagent[J]. Chemical Reagents, 2015, 37(09): 769-775+798(in Chinese).

[2] Wehmeyer K R, Knight P M, Parry R C. Evaluation of a benchtop ion trap gas chromatographic-tandem mass spectrometric instrument for the analysis of a model drug, tebufelone, in plasma using a stable-isotope internal standard[J]. J Chromatography, B: Biomed. Appl, 1996, (676): 53-59.

[3] Kao C Y, Giese R. Measurement of N7-(2’-Hydroxyethyl) guanine in human DNA by gas chromatography electron capture mass spectrometry[J]. Chem Res Toxicol,2005, 18: 70-75.

[4] Wang H, Hussain A A, Pyrek J S, et al. Assay for nipecotic acid in small blood samples by gas chromatography-mass spectroscopy[J]. J Pharm Biomed Anal, 2004, 34: 1 063-1 070.

[5] Jemal M, Xia Y Q. LC-MS development strategies for quantitative bioanalysis[J]. Curr Drug Metab, 2006, (7): 491-502.

[6] Allen G D, Brookes S T, Barrow A, et al. Liquid chromatographic-tandem mass spectrometric method for the determination of the neuraminidase inhibitor zanamivir (GG167) in human serum[J]. J Chromatography, B: Biomed Appl, 1999, (732): 383-393.

[7] 顏廷帥，楊巧梅. 連續(xù)化管道反應(yīng)器制備對(duì)甲氧基苯甲酸[J]. 化工設(shè)計(jì)通訊,2017,43(02):198-202.

Yan Tingshuai, Yang Qiaomei. Preparation of p-methoxybenzoic acid by continuous pipeline reactor[J]. Chemical Engineering Design Communications, 2017, 43(02): 198-202(in Chinese).

[8] 孟祥軍，張寶發(fā)，葛欣. 對(duì)甲氧基苯甲酸的制備[J]. 化學(xué)世界，1995,(2):83-84.

Meng Xiangjun, Zhang Baofa, Ge Xin. Preparation of p-methoxybenzoic acid[J]. Chemical World, 1995, (2): 83-84(in Chinese).

[9] 鄧啟華. 相轉(zhuǎn)移催化法制備對(duì)甲氧基苯甲酸[J]. 四川化工,1995,(S3):15.

Deng Qihua. Study on preparation of p-methoxybenzoic acid by phase transfer catalysis[J]. Sichuan Chemical Industry, 1995, (S3): 15(in Chinese).

[10] Derdau V, Fey T, Atzrodt J. Synthesis of isotopically labelled SGLT inhibitors and their metabolites[J]. Tetrahedron, 2009, 66(7): 1 472-1 482.

[11] Mazzotti F, Di Donna L, Napoli A, et al. N-hydroxysuccinimidyl p-methoxybenzoate as suitable derivative reagent for isotopic dilution assay of biogenic amines in food[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2014, 49(9): 802-810.