界面蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)的和頻振動光譜研究

魏 鋒 ，談軍軍 ，張佳慧 ，李傳召 ，汪文婷 ，羅 毅 ，葉樹集

1中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心，合肥，安徽，230026 2江漢大學(xué)交叉學(xué)科研究院，光電化學(xué)材料與器件教育部重點實驗室，武漢，湖北，430056

目 錄

I.引言132

A.界面蛋白質(zhì)分子的重要性 132

B.界面蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)研究難點及常規(guī)技術(shù) 133

II.界面蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)表征有效技術(shù)：和頻振動光譜 134

A.和頻振動光譜簡介 134

B.和頻振動光譜研究界面蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析方法 135

III.和頻振動光譜在研究界面蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用 136

A.α-螺旋結(jié)構(gòu) 136

B.310螺旋結(jié)構(gòu) 137

C.β-折疊結(jié)構(gòu) 138

D.無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu) 138

IV.和頻振動光譜在研究界面蛋白質(zhì)動力學(xué)中的應(yīng)用 139

A.無規(guī)則卷曲?α-螺旋轉(zhuǎn)變 139

B.無規(guī)則卷曲?α-螺旋?β-折疊轉(zhuǎn)變 140

C.離子通道動力學(xué)過程 141

D.界面蛋白質(zhì)酰胺鍵振動能量轉(zhuǎn)移 141

V.結(jié)論與展望 142

致 謝

143

參考文獻 143

I.引言

A.界面蛋白質(zhì)分子的重要性

蛋白質(zhì)是自然界以及生命體內(nèi)廣泛存在的組分。蛋白質(zhì)與界面的相互作用是自然界中一種非常普遍但又十分復(fù)雜的現(xiàn)象，其在物理、生物技術(shù)、化學(xué)工程、藥物、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域中發(fā)揮著極其重要的作用。特別是，蛋白質(zhì)是維系細胞結(jié)構(gòu)完整性不可或缺的成分，是生命體執(zhí)行細胞膜上選擇性物質(zhì)傳遞和信號傳導(dǎo)等特定生理功能的分子機器。而生理功能的實現(xiàn)主要依賴于細胞膜上內(nèi)源性蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象的變化，例如，離子通道蛋白質(zhì)通過改變α-螺旋片段與310螺旋片段的傾斜角與夾角來實現(xiàn)通道的打開與關(guān)閉[1]；細胞膜上GPRB蛋白通過改變細胞膜內(nèi)G蛋白亞基構(gòu)象和釋放信號分子來實現(xiàn)自身的激活[2?3]。另一方面，生物膜界面蛋白質(zhì)保持正常的結(jié)構(gòu)與功能是維持生命過程的基礎(chǔ)。它的錯誤折疊引起的功能障礙與老年性癡呆癥、帕金森、糖尿病、瘋牛病等許多疾病的發(fā)生和發(fā)展直接相關(guān)[4?6]。同時，外源性蛋白質(zhì)入侵細胞膜，可以破壞細胞膜對外界環(huán)境的隔離，導(dǎo)致細胞的病變，比如蜂毒素的入侵可誘導(dǎo)細胞膜破裂，離子外流，細胞凋亡等一系列反應(yīng)[7?8]。此外，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，很多用于免疫測試和可控藥物運輸?shù)尼t(yī)療器械與生物傳感器也離不開界面蛋白質(zhì)的參與和調(diào)控[9?13]。原位實時精確地表征界面蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化及其動力學(xué)行為是揭示界面蛋白質(zhì)功能的核心，在闡明神經(jīng)退化型疾病的病理機制、調(diào)控細胞功能、開發(fā)新型生物相容性功能器件以及篩選藥物分子中發(fā)揮非常重要的作用。

簡稱列表

B.界面蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)研究難點及常規(guī)技術(shù)

蛋白質(zhì)分子是一個非常復(fù)雜的體系。蛋白質(zhì)是以氨基酸為基本單元構(gòu)成的生物高分子，氨基酸的排列順序及由此而形成的立體構(gòu)象造就了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性(圖1)，進而造就了其功能的多樣性。此外，細胞膜是一個具有一定流動性的復(fù)雜體系，其主要組成部分為厚度僅有幾個納米的磷脂雙分子層。細胞膜上的界面蛋白質(zhì)體系尤為復(fù)雜[14]。研究這一復(fù)雜體系不僅要求表征技術(shù)具有足夠高的結(jié)構(gòu)分辨度和時間分辨度，還需同時滿足時間、空間、活體、非介入性等要求。

近年來，核磁共振(Nuclear magnetic resonance:NMR)[15]、X-射線晶體衍射[16]、X-光電子能譜 (X-ray photo-electron spectroscopy:XPS)[17]、二級離子質(zhì)譜 (Secondary ion mass spectrometry: SIMS)[18]、掃描電子顯微鏡 (Scanning electron microscopy:SEM)[19,20]、 表面等離子體共振 (Surface plasmon resonance:SPR)[21]、原子力顯微鏡(Atomic force microscopy:AFM)[22]、熒光探測、衰減全反射傅利葉紅外光譜、圓二色譜、電子自旋共振、中子散射、橢圓光度法等許多技術(shù)手段已經(jīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究[23?27]。利用這些技術(shù)，可以從分子水平上測出蛋白質(zhì)與界面相互作用的信息，例如，表面等離子體共振儀可有效測出界面上蛋白質(zhì)或多肽的覆蓋率[28?30]。但是這些技術(shù)存在以下局限性：需要在真空環(huán)境下操作、靈敏度不夠高、無法獲得界面環(huán)境中的蛋白質(zhì)(多肽)分子的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)。此外，這些技術(shù)存在著諸多的限制與不足，難以捕獲真實的信息。比如，X-射線晶體衍射只適用于處于結(jié)晶狀態(tài)的蛋白質(zhì)(多肽)，而結(jié)晶過程很可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)(多肽)的變性。核磁共振雖然廣泛用于研究界面蛋白質(zhì)(多肽)，但是它的靈敏度很低，實驗中樣品用量很大，難以獲得蛋白質(zhì)(多肽)分子的絕對取向角度。此外，微胞尺寸對液體核磁共振結(jié)果有較大影響，固體核磁共振也常常受到樣品的限制：樣品中可能含有多層磷脂雙層膜，然而生物體系中的細胞膜主要由一層磷脂雙層膜組成；另外固體核磁共振實驗中很難制備出內(nèi)層和外層組成不同的磷脂雙層膜樣品[31]。特別是，這些生物學(xué)常規(guī)技術(shù)很難同時滿足高結(jié)構(gòu)分辨度和高時間分辨度，以及時間、空間、活體、非介入性等要求。因此，如何在超快時間尺度上研究界面蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)依然是現(xiàn)代生物科學(xué)中的一個挑戰(zhàn)，同時也是生物、物理與化學(xué)交叉學(xué)科中非常重要的前沿科學(xué)問題。

最近發(fā)展的具有界面選擇性的和頻振動光譜(sum frequency generation vibrational spectroscopy:SFGVS)技術(shù)則是可以同時滿足這些要求的為數(shù)不多的技術(shù)之一[32?41]。由于它獨特的表、界面選擇性和單分子層靈敏度，和頻振動光譜目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種界面環(huán)境下的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)表征[42?58]。例如，實時原位表征界面上 IAPP、Prion等淀粉狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，解釋其結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的具體過程與形成聚集體的機理[59?61]；探測抗菌肽分子入侵細胞膜過程，從分子水平上揭示其與細胞膜相互作用的機理[62?65]；監(jiān)控生物膜上離子通道蛋白質(zhì)模型丙甲甘肽在 pH驅(qū)動下的通道開關(guān)過程，闡明通道開關(guān)機理[1]。表I列出了一些利用和頻振動光譜技術(shù)來研究界面蛋白質(zhì)分子與界面多肽分子的綜述。本綜述將主要介紹和頻振動光譜研究界面蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)的方法、發(fā)展歷史、及其應(yīng)用。

圖1.蛋白質(zhì)組裝體示意圖

II.界面蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)表征有效技術(shù)：和頻振動光譜

A.和頻振動光譜簡介

和頻振動光譜是三十年前發(fā)展起來的一種二階非線性光學(xué)技術(shù)[66]。其基本原理是兩束光，一束紅外光，一束可見光或紫外光，在時間和空間上同時作用于表面或者界面上，然后產(chǎn)生第三束光，叫和頻光，如圖2所示。它通過紅外光對分子振動能級的激發(fā)與可見光對電子能級的激發(fā)產(chǎn)生一個三光子相干躍遷過程。該過程實質(zhì)上可看作是一個紅外振動激發(fā)和一個反斯托克斯拉曼散射的組合過程，因此該技術(shù)要求被測分子同時具有紅外活性和拉曼活性。理論上，和頻光譜的強度與界面分子二階極化率的平方、兩束入射光的強度I1(ωvis)、I2(ωIR) 成正比[32?41]：

其中ωSFG，ωIR與ωvis分別是和頻光頻率，紅外光頻率與可見光頻率，并滿足ωSFG=ωIR+ωvis，c是光速；ni(ωj)是頻率為ωj的光在介質(zhì)i內(nèi)傳播的折射率；β是SFG的出射角；是含菲涅爾系數(shù)的有效非線性極化率。當(dāng)紅外光頻率范圍內(nèi)有對應(yīng)的分子振動能級時，和頻光譜信號得到增強。隨紅外光頻率的變化可以表示為：

其中Aν,ων,和 Γν分別對應(yīng)每一個振動模式（ν）的振動峰強度，振動峰頻率與振動峰峰寬，ei·φν為振動模式的相位因子，并將不同振動模式對和頻光譜信號的貢獻進行加和。

圖2.和頻光譜原理和光路示意圖

根據(jù)二階非線性光學(xué)過程的對稱性選擇定則，在電偶極近似下，具有中心對稱性的分子或介質(zhì)中的二階極化率始終為零，不能產(chǎn)生和頻信號。因而，和頻光譜具有非常高的表界面選擇性和靈敏性。利用和頻光譜技術(shù)，我們不僅可以將表面或界面的分子振動光譜信號和體相信號區(qū)分開，還可以測出表面或界面上的分子與功能團的取向[32?41]。 總的來說，和頻振動光譜可以提供以下幾方面的信息：1)界面上存在的分子基團；2)界面分子排列的有序程度；3)界面分子的結(jié)構(gòu)變化；4)界面官能團取向；5)分子手性結(jié)構(gòu)；6)界面分子吸附動力學(xué)；7)界面氫鍵網(wǎng)絡(luò)強弱與重構(gòu)；8)界面超快能量轉(zhuǎn)移過程。目前，該技術(shù)在界面分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)的研究中發(fā)揮了極其重要作用。研究的界面包括固/固，固/液，固/氣，液/液等體系；研究對象十分廣泛，從水分子，聚合物，蛋白質(zhì)，甚至到DNA都有涉及。

表I.一些界面蛋白質(zhì)的和頻振動光譜研究綜述[43]

B.和頻振動光譜研究界面蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析方法

自從1987年被發(fā)展以來，和頻振動光譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種界面環(huán)境下的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)表征（綜述文獻見表 I）。通過測量蛋白質(zhì)分子上的不同基團與不同二級結(jié)構(gòu)的譜學(xué)特征，和頻光譜可以提供用于闡明界面蛋白質(zhì)分子的作用機理和病變機制等科學(xué)問題的有力證據(jù)。早期的研究主要集中在CH伸縮振動波段 (2800-3200 cm?1)。例如 Cremer等人利用gramicidin A分子吸附于d-DMPC單層膜上后產(chǎn)生的CH伸縮振動光譜，來表征gramicidin A分子的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)[67]。但是從CH伸縮振動光譜內(nèi)獲取蛋白質(zhì)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的同時，也會受到生物膜中的碳鏈結(jié)構(gòu)和界面吸附的其他碳基分子基團的干擾，因此該方法較難用于定量分析。另一方面，蛋白質(zhì)是由一個一個氨基酸通過脫水縮合反應(yīng)形成酰胺鍵，通過酰胺鍵把各個氨基酸連接成蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，酰胺鍵之間再通過形成不同的氫鍵結(jié)構(gòu)進而產(chǎn)生蛋白質(zhì)的二級、三級和更高級的結(jié)構(gòu)（圖1）。一般而言，不同蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)具有不同的對稱性和不同的氫鍵結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生具有不同頻率的酰胺鍵骨架振動，如表 II所示。表II列出了不同蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的對稱性、振動模式、已報道的和頻光譜振動峰位置以及手性結(jié)構(gòu)等信息。表II顯示所有酰胺譜帶都是結(jié)構(gòu)敏感的，而且酰胺譜帶受蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的影響較大而受側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的影響較小。因而，如果我們要表征界面蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，需重點觀察蛋白質(zhì)酰胺鍵的振動。事實上，基于蛋白質(zhì)酰胺鍵骨架振動的酰胺特征譜帶與二級結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性已經(jīng)得到大量紅外光譜和拉曼光譜數(shù)據(jù)的支持[68?69]。酰胺鍵骨架振動主要存在于三個能量區(qū)域：處于功能團振動區(qū)域 (≥1600 cm?1)的酰胺 I譜帶，處于指紋區(qū) (＜1600 cm?1)的酰胺 II和酰胺 III譜帶[70](圖3)。酰胺I譜帶主要來自于C=O伸縮振動和少量的C-N面外伸縮振動；酰胺II譜帶主要來自于C-N伸縮振動和N-H面外彎曲振動；酰胺III譜帶則主要來自于C-N伸縮振動和N-H面內(nèi)彎曲振動[68?70]。酰胺II和酰胺III信號本身就很弱，到了界面則變得更加微弱，常規(guī)方法很難測出來。目前國內(nèi)外學(xué)者主要是通過測量酰胺I信號來表征界面蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

圖3.蛋白質(zhì)酰胺鍵振動模式示意圖

Chen等人在 2005年首次測出界面蛋白質(zhì)/多肽分子的酰胺 I譜帶和頻光譜信號。利用近全反射的實驗構(gòu)型，他們獲得很強的界面蛋白質(zhì)的酰胺 I信號[71,72]。從那以后，很多小組開始運用和頻振動光譜來表征界面蛋白質(zhì)的排列和取向結(jié)構(gòu)。但是酰胺I信號存在兩個弱點：一是振動峰位置與水分子彎曲振動位置重疊；二是各個二級結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的酰胺I譜帶集中在1600～1700 cm?1，因此具有不同分子結(jié)構(gòu)的振動峰有可能重疊在一起，例如，α-螺旋與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的振動峰均位于～1655 cm?1。要把這樣復(fù)雜的結(jié)構(gòu)區(qū)分開來，需要發(fā)展新的研究理念和方法。最近本小組成功解決了測量酰胺II和酰胺III弱信號這一技術(shù)難關(guān)。通過酰胺I和酰胺III信號的同時觀測，成功解決了區(qū)分界面蛋白質(zhì)α-螺旋與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)這一界面表征難題[73]。

III.和頻振動光譜在研究界面蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用

根據(jù)酰胺鍵骨架的氫鍵結(jié)構(gòu)不同，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)可分為無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)折結(jié)構(gòu)等。目前和頻振動光譜已經(jīng)成功地應(yīng)用于這些結(jié)構(gòu)的測量和動態(tài)監(jiān)控。

A. α-螺旋結(jié)構(gòu)

α-螺旋結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)/多肽分子中最常見的二級結(jié)構(gòu)。很多通道蛋白通過多個α-螺旋來構(gòu)建離子通道。大部分的抗菌肽在細胞膜上也是通過形成α-螺旋結(jié)構(gòu)來完成插入并破壞細胞膜的操作[58]。過去研究表明，和頻振動光譜是一種能夠在分子水平上進行生物膜上蛋白質(zhì)與多肽結(jié)構(gòu)及其動力學(xué)研究的有效手段。目前，已經(jīng)被和頻振動光頻研究過的具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的物質(zhì)包括：LKα14[75?78]、ovispirin-1[79]、mastoparan(MP)[80,81]、cecropin P1(CP-1)[10,82?85]、pardaxin[73,86]、melittin[62,87]等。這些物質(zhì)的研究已被部分總結(jié)在最近發(fā)表的綜述上[42,51]。這里我們以蜂毒素MP分子為例，通過對多肽分子α-螺旋結(jié)構(gòu)的取向分析，介紹如何利用和頻振動光譜研究不同離子濃度和pH值下蜂毒素在生物膜上的分子結(jié)構(gòu)響應(yīng)，進而獲得MP分子與不同細胞膜的作用機理。

鹽離子的獨特效應(yīng)無處不在。地球上海水含量占全球總水量的95%以上，海水中含有3.5%左右的無機鹽。此外，人體內(nèi)水含量超過了體重的三分之二，且體液中包含著大量無機鹽離子，濃度約為0.15M。這些無機鹽離子的存在會對蛋白質(zhì)與界面相互作用產(chǎn)生顯著影響，直接關(guān)系到蛋白質(zhì)在界面的吸附、穩(wěn)定、折疊與凝聚途徑。從分子水平上理解離子調(diào)控蛋白質(zhì)與界面之間相互作用的機理是物理、化學(xué)與生物交叉學(xué)科中一個非常重要的前沿科學(xué)問題。針對這個問題，我們利用和頻振動光譜系統(tǒng)研究了鹽離子如何影響蛋白質(zhì)在不同電荷和不同親疏水性質(zhì)的固體支撐界面上的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)行為。我們在研究疏水長度為2.1 nm的MP與疏水長度為2.3 nm的帶不同種電荷的磷脂分子雙層膜的相互作用時發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽離子不僅能加速MP插入到帶負電荷的DMPG和中性DMPC磷脂雙層膜的進程，竟也能助其插入到帶正電荷的 DMEPC磷脂膜中[81]，見圖 4B。圖 4A中，MP分子與純水環(huán)境下（C=0 mM）的DMPG雙層膜作用時，只觀測到一個位于 1665 cm?1左右的較弱的寬峰，說明 MP在純水環(huán)境的生物膜下只能形成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。隨著磷酸鹽緩沖溶液濃度的上升，MP分子的光譜峰位移至1655 cm?1左右，且光譜強度隨離子強度的增加而增大，說明磷酸鹽緩沖溶液的加入促進了 MP分子α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成，并有效促進α-螺旋結(jié)構(gòu)多肽分子與細胞膜的相互作用。通常而言，MP帶正電荷，帶正電的MP與帶正電荷的 DMEPC作用在能量上是不利的。為了理解該現(xiàn)象，我們還研究了其他帶正電荷的多肽分子(MPX,melittin和 LKα14)與正電荷 DMEPC生物膜的相互作用。結(jié)果表明，在磷酸鹽離子溶液中，MP-X,melittin和LKα14也能插入到帶正電荷的DMEPC生物膜中[81]。在此基礎(chǔ)上，我們還進一步研究了不同生物膜疏水長度，鹽離子種類以及無磷酸根基團的脂質(zhì)分子膜對 MP與生物膜相互作用的影響。結(jié)果表明，在磷酸鹽離子中，MP不僅能插入到疏水長度較短的DLPC(1.95 nm)和DMPC(2.3 nm)雙層膜中，同時也能插入到疏水長度是 MP兩倍的 DPPC(3.6 nm)和 DSPC(4.05 nm)雙層膜中 (圖 4C)[80]。通過改變?nèi)芤旱碾x子種類，我們發(fā)現(xiàn)離子的水合化Gibbs自由能與插入到DMPC雙層膜的MP分子數(shù)量成線性關(guān)系(圖4D)，說明離子改變了體系的水合作用，從而驅(qū)動MP插入到生物膜中。同時研究表明，MP與生物膜上帶正電荷的膽堿基團作用是MP插入到生物膜過程中重要的一步[80]。

表II.蛋白質(zhì)不同二級結(jié)構(gòu)的特征信息[44,45,48,74]

圖4.A)DMPG雙層膜中MP分子的ssp偏振酰胺I光譜隨磷酸鹽緩沖溶液濃度的變化。B)負電荷DMPG、中性DMPC與正電荷DMEPC雙層膜中 MP分子的和頻光譜ppp和ssp偏振擬合強度隨磷酸鹽緩沖溶液濃度的變化。C)磷酸鹽緩沖溶液存在時MP分子與DLPC，DPPC和DSPC雙層膜作用的ssp和頻光譜圖。D)不同離子種類下和頻光譜擬合強度與離子水合化吉布斯自由能的關(guān)聯(lián)。圖片摘自文獻80和 81，版權(quán)所有 American Chemical Society。

B.310螺旋結(jié)構(gòu)

310螺旋雖然在自然界蛋白質(zhì)中占比例較少，在已知的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中僅占有10%左右，但其也是一種重要的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。310螺旋主要存在于臨近α-螺旋結(jié)構(gòu)的位置。包含α-氨基異丁酸的多肽片段較易形成310螺旋，例如丙甲甘肽(Alamethicin)[11]。丙甲甘肽是一個含有20個氨基酸的多肽分子，晶體數(shù)據(jù)顯示，它可以同時形成310螺旋和α-螺旋結(jié)構(gòu)[11]。丙甲甘肽由于其特殊結(jié)構(gòu)被廣泛用作電壓門控離子通道的模型蛋白分子。本小組利用和頻光譜研究了沒有外加電場情況下丙甲甘肽分子在不同磷脂膜上的結(jié)構(gòu)。如圖5所示，當(dāng)丙甲甘肽分子與流動相細胞膜(d-DMPC/DMPC雙層膜)作用時，光譜中有兩個明顯的特征峰，峰的中心分別在1635 cm?1和 1670 cm?1，這兩個峰分別是310螺旋和α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰。由于310螺旋的影響，丙甲甘肽α-螺旋的特征峰位置相比其他多肽α-螺旋特征峰位置（1655 cm?1）出現(xiàn)了藍移。通過對 310螺旋和α-螺旋結(jié)構(gòu)進行取向分析，可以知道兩種二級結(jié)構(gòu)的取向角分別為 43°和 63°。當(dāng)丙甲甘肽分子與凝聚相細胞膜(d-DPPC/DPPC雙層膜)作用時，只能躺在凝膠相磷脂雙層膜表面并形成聚集態(tài)，結(jié)果酰胺I振動峰位移到了1685 cm?1(其中位于1720 cm?1的振動峰來自磷脂分子的C=O基團)[11]。此外，密歇根大學(xué)陳戰(zhàn)教授小組還研究了鹽溶液濃度與磷脂雙層膜相轉(zhuǎn)變過程對丙甲甘肽分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象的影響[88,89]。

圖5. pH=6.7時丙甲甘肽分子在不同細胞膜 (a)POPC/POPC;(b)POPC/POPG;(c)d-DMPC/DMPC;(d)d-DMPC/d-DMPC;(e)d-DPPC/DPPC;(f)d-DPPG/DPPG;(g)d-DSPC/DSPC上的 ppp光譜以及丙甲甘肽在不同膜上的結(jié)構(gòu)示意圖。圖片摘自文獻11，版權(quán)所有 American Chemical Society。

C. β-折疊結(jié)構(gòu)

β-折疊結(jié)構(gòu)存在于蠶絲蛋白、蜘蛛網(wǎng)以及蛋白纖維中。和頻振動光譜研究過的β-折疊物質(zhì)包括 Prion[61]、LK7β[74,90]、IAPP[56,60,91?93]，詳細的總結(jié)見最近的綜述《Chemical Reviews》[44]。這里以朊蛋白(Prion)為例進行介紹。朊蛋白是海綿狀腦病(瘋牛病)的關(guān)鍵蛋白分子。前人的研究表明朊蛋白從α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成β-折疊結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，是朊蛋白在神經(jīng)細胞中發(fā)生聚集，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死的主要原因。但是，朊蛋白引起神經(jīng)細胞死亡的機制還不清楚，特別是低濃度下朊蛋白發(fā)生的構(gòu)象變化與聚集機制需要進一步研究。我們用朊蛋白的片段PrP118-135作為模型分子[61]，利用和頻光譜原位實時研究了PrP118-135與負電荷磷脂POPG雙層膜的相互作用。如圖6所示，隨著PrP118-135分子濃度的逐漸上升，ssp光譜和ppp光譜中1655 cm?1處α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰強度并沒有單調(diào)上升，而psp光譜中1620 cm?1處β-折疊結(jié)構(gòu)的特征峰強度卻逐漸上升。通過分析不同多肽濃度下的酰胺I譜帶信號，可以獲得PrP118-135的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過程和取向信息。我們發(fā)現(xiàn)在多肽濃度較低時，90%以上的PrP118-135在POPG雙層膜中采取α-螺旋結(jié)構(gòu)而10%以下的分子是β-折疊結(jié)構(gòu)。隨著多肽濃度的增大，β-折疊結(jié)構(gòu)所占的比例逐漸增大。在多肽濃度為0.10 mg/mL時，β-折疊結(jié)構(gòu)的分子比例達到44%（見表III）。這表明PrP分子在低濃度（＜0.10 mg/mL）下，就可以形成致病的β-折疊結(jié)構(gòu)。這些β-折疊結(jié)構(gòu)的朊蛋白有可能成為低聚物的核心，從而引發(fā)神經(jīng)細胞的病變。該研究從分子水平上揭示了PrP118-135在細胞膜中的早期構(gòu)象變化，對于理解朊蛋白引發(fā)疾病及疾病初期的發(fā)展過程非常重要。

表 III.不同濃度的PrP所對應(yīng)的 α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)在膜中的相對分子數(shù)目比例[61]

D.無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)

無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)實現(xiàn)其功能的重要部分。但是在酰胺I譜帶中，無規(guī)則卷曲的特征峰與α-螺旋的特征峰幾乎是重合的，很難將這兩種結(jié)構(gòu)區(qū)分開，這無疑給蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的精確表征帶來了很多困難。當(dāng)把和頻光譜的檢測范圍擴展到1150-1350 cm?1區(qū)間時，我們發(fā)現(xiàn)，通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的酰胺III波段可以準(zhǔn)確分辨出無規(guī)則結(jié)構(gòu)與α-螺旋結(jié)構(gòu)，它們的振動峰分別位于1260 cm?1以下和1260 cm?1以上[73]。從表IV中可以看出，MP-X、CP-1、Pardaxin和Melittin四種多肽分別具有不同比例的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。但僅從這四種多肽的酰胺I譜帶ssp光譜中并不能看出很大的差別（如圖7B所示），而從這四種多肽酰胺III譜帶的ssp光譜卻可以看出明顯的差別（圖7C）。此外，當(dāng)無規(guī)則結(jié)構(gòu)比例不同時，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)特征峰的峰強與峰位置也發(fā)生了改變。同時兩種結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的酰胺III譜帶特征峰面積比與蛋白質(zhì)中的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量存在一定的線性關(guān)系。這些結(jié)果表明，將酰胺 I波段和酰胺III波段的和頻振動光譜信息進行結(jié)合，可以非常有效地分辨出無規(guī)則卷曲與α-螺旋這兩種二級結(jié)構(gòu)，可用于這兩種二級結(jié)構(gòu)相對含量的估計。

表IV.α-螺旋比例與酰胺III譜帶譜圖擬合參數(shù)[73]

IV.和頻振動光譜在研究界面蛋白質(zhì)動力學(xué)中的應(yīng)用

和頻振動光譜不僅可用于測量界面蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，還可以用于監(jiān)控蛋白質(zhì)的動態(tài)轉(zhuǎn)變、界面折疊過程和界面蛋白質(zhì)能量轉(zhuǎn)移等動態(tài)過程。

A.無規(guī)則卷曲 ?α-螺旋轉(zhuǎn)變

從無規(guī)卷曲到α-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是膜蛋白折疊的第一步。之前因為缺乏有效區(qū)分這兩種結(jié)構(gòu)的界面技術(shù)，實驗上很難研究界面蛋白質(zhì)的折疊過程，因而對該過程在哪里發(fā)生、什么時候發(fā)生、怎樣發(fā)生了解甚少。無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)如何成核，如何轉(zhuǎn)變成α-螺旋結(jié)構(gòu)仍然是未解難題。通過研究生物膜電荷對多肽分子pardaxin在生物膜上的折疊過程的影響，我們證實酰胺III信號可以用作膜蛋白折疊過程的分子探針。

我們首先研究pardaxin分子在d-DMPC雙層膜上的作用過程[86]。從圖8A中pardaxin分子酰胺III波段ssp光譜隨時間的變化可以看到，在1240 cm?1(peak1)與 1290 cm?1(peak2)處出現(xiàn)兩個特征峰，說明pardaxin分子包含了兩種不同的二級結(jié)構(gòu)：無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)與α-螺旋結(jié)構(gòu)。從圖8B中隨時間變化的峰強和峰強比例變化趨勢可以看出，雖然pardaxin分子在d-DMPC雙層膜上的吸附量隨時間逐漸上升，但是pardaxin分子兩種結(jié)構(gòu)之間的比例并沒有發(fā)生非常大的改變。這表明在我們觀測的時間范圍內(nèi)，主要發(fā)生的是pardaxin分子在d-DMPC雙層膜上的吸附/插入過程，而并沒有發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。

隨后，我們原位實時地檢測 pardaxin分子在d-DMPG雙層膜上的作用過程。圖 9A顯示 ssp光譜在作用初期出現(xiàn)了 1230 cm?1(peak1)與 1280 cm?1(peak2)兩個特征峰。隨時間的推移，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的特征峰強逐漸減弱。兩個峰的位置也逐漸遷移至 1240 cm?1(peak1)與 1290 cm?1(peak2)。從圖 9C中兩個峰的峰強比例變化趨勢可以看出，pardaxin分子的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的比例隨時間的延長而逐漸下降。這說明在實驗觀測的時間范圍內(nèi)，吸附在d-DMPG雙層膜上的pardaxin分子發(fā)生了一定的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，其中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比例逐漸減少，α-螺旋結(jié)構(gòu)比例逐漸增加。這些結(jié)果表明，細胞膜上的負電荷可以促進pardaxin分子在細胞膜中的插入、組裝和α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成。這些認識有助于我們深層次理解界面蛋白質(zhì)的折疊與組裝機理。在此基礎(chǔ)上，我們還探索出了生物膜上pH誘導(dǎo)的酸感應(yīng)蛋白質(zhì)折疊的可逆性規(guī)律[94]。

圖7.1)MP-X、2)CP-1、3)Pardaxin和4)Melittin在磷脂雙層膜上的酰胺I和酰胺III譜帶ssp譜圖，(A)根據(jù)NMR的結(jié)果給出的以上這四種多肽的二級結(jié)構(gòu)圖：紅色代表α-螺旋結(jié)構(gòu)、藍色代表無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，(B)酰胺I譜帶，(C)酰胺III譜帶。圖片摘自文獻73，版權(quán)所有American Chemical Society。

圖8.d-DMPC磷脂雙層膜中pardaxin分子的A）酰胺III波段的 ssp光譜，B）1655 cm?1處譜峰強度，1290 cm?1處譜峰強度，以及譜峰強度比隨時間的變化。圖片摘自文獻 86，版權(quán)所有 American Chemical Society。

圖9.d-DMPG磷脂雙層膜中pardaxin分子的A）酰胺III波段ssp光譜隨時間的變化，B）酰胺I波段ssp光譜，C）譜峰強度比隨時間的變化。圖片摘自文獻 86，版權(quán)所有 American Chemical Society。

B.無規(guī)則卷曲 ?α-螺旋 ?β-折疊轉(zhuǎn)變

蛋白質(zhì)錯誤折疊會導(dǎo)致II型糖尿病等神經(jīng)退化型疾病的產(chǎn)生。錯誤折疊涉及β-折疊的生成及其纖維化過程。Elsa Yan等人通過探測手性與非手性和頻光譜對hIAPP在DPPG單層膜上的結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)變化動力學(xué)進行了研究[44,59,91]。hIAPP是一種II型糖尿病相關(guān)蛋白質(zhì)，它的錯誤折疊以及纖維化是造成胰島β-細胞凋亡的主要原因。如圖10所示，經(jīng)過了10個小時的作用后，hIAPP分子酰胺I的ssp光譜中的振動峰產(chǎn)生了明顯的藍移，而酰胺I的psp光譜在1620 cm?1處出現(xiàn)了明顯的振動峰。1620 cm?1處振動峰的出現(xiàn)表明 hIAPP分子形成了平行β-折疊結(jié)構(gòu)。圖10B展示的是hIAPP分子和頻光譜隨時間的變化過程。從酰胺I的ssp光譜中可以看到，hIAPP分子的特征峰位置從1655 cm?1逐漸藍移至1660 cm?1。酰胺I的psp光譜中1620 cm?1處振動峰在200分鐘之后才開始出現(xiàn)并逐漸增強；酰胺A的psp光譜中3285 cm?1處的特征峰強度在200分鐘之后才開始出現(xiàn)并逐漸上升，在3小時后到達最高點，隨后又逐漸降低，最終在10小時后完全消失。由于酰胺 A波段中 3285 cm?1處振動峰是來自于α-螺旋結(jié)構(gòu)，所以，以上結(jié)果表明在與DPPG單層膜相互作用時，hIAPP首先從無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋結(jié)構(gòu)，然后又從α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫笑?折疊結(jié)構(gòu)（詳見圖 10C）。這些結(jié)果有助于我們理解II型糖尿病的發(fā)病機制和細胞膜上淀粉狀多肽聚集的形成機理。這些實驗也展示了和頻振動光譜的手性光譜可作為一種非常有效的動力學(xué)表征方法以應(yīng)用于界面生物大分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象變化的原位實時檢測。

C.離子通道動力學(xué)過程

和頻振動光譜除了可以用來研究界面蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，還可以用來揭示離子通道開放和關(guān)閉這樣的復(fù)雜過程。雖然 Peter Agre和 Roderick MacKinnon因發(fā)現(xiàn)離子通道蛋白質(zhì)于 2003年獲得諾貝爾化學(xué)獎[95?97]，但是目前人們對通道在開放與關(guān)閉過程中各個電壓傳感多肽的運動情況仍不明朗。理論上存在三種有爭議的模型，分別為：螺旋螺桿模型，轉(zhuǎn)運模型，以及槳模型[95?97]。針對這一現(xiàn)狀，我們探索了利用和頻振動光譜來研究這種復(fù)雜模型過程的可能性，以大型離子通道模型丙甲甘肽作為研究對象，研究其在細胞膜上的結(jié)構(gòu)變化動力學(xué)[1]。 前人研究表明，通過加入磷酸鹽，磷脂分子頭部的磷酸根基團能與多肽上的精氨酸基團形成強氫鍵相互作用，形成鹽橋結(jié)構(gòu)，進而改變膜電位，由此激活離子通道。從圖11中不同pH值下丙甲甘肽分子酰胺I波段的ppp光譜與ssp光譜對比可以看出，pH的上升不僅引起了酰胺I波段光譜強度的明顯增大，ssp光譜與ppp光譜強度之間比例也發(fā)生了明顯的變化。如圖12所示，隨著K3PO4的加入（pH值從6.7變成11.9），丙甲甘肽分子1665 cm?1處的和頻光譜信號發(fā)生了快速的變化，于400秒后達到平衡。同時取向分析結(jié)果顯示，丙甲甘肽分子在受到pH值變化的外界刺激之后，310螺旋和α-螺旋結(jié)構(gòu)的取向角度分別由72°和 50°變成了56.5°和45°。這些結(jié)果表明離子通道蛋白在受到外界刺激時，通過兩種分子構(gòu)象的同時變化（取向角減小和片段之間的角度差減少）來實現(xiàn)通道的開放[1]。

D.界面蛋白質(zhì)酰胺鍵振動能量轉(zhuǎn)移

蛋白質(zhì)分子能量轉(zhuǎn)移對生化反應(yīng)及生理功能的正常運作至關(guān)重要，許多重要的生理和細胞過程都依賴于蛋白質(zhì)的超快能量轉(zhuǎn)移過程，例如，構(gòu)象變化傳輸和變構(gòu)通訊與沿蛋白質(zhì)骨架上的能量傳輸直接相關(guān)?？焖偾矣行У哪芰哭D(zhuǎn)移是蛋白質(zhì)維持在很窄溫度范圍內(nèi)正常工作的重要保證。因而，理解生物膜界面蛋白質(zhì)的能量轉(zhuǎn)移過程是揭示膜蛋白質(zhì)工作機制的關(guān)鍵。但是，迄今為止,人們對蛋白質(zhì)（特別是界面蛋白質(zhì)）能量轉(zhuǎn)移的了解十分有限。這主要是因為能量傳遞過程往往牽涉皮秒或更短時間尺度內(nèi)的激發(fā)態(tài)動力學(xué)，而目前在理論和實驗上對激發(fā)態(tài)動力學(xué)，尤其是界面激發(fā)態(tài)動力學(xué)的精確描述還缺乏行之有效的方法和數(shù)據(jù)積累。最近我們獨立搭建了振動態(tài)選擇激發(fā)-和頻光譜探測的飛秒時間分辨測量系統(tǒng)。該系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)達到當(dāng)前國際最先進水平：時間分辨度 100 fs，光譜分辨度≤5 cm?1，能實現(xiàn)目前文獻報道中最快的和頻光譜采譜速度（采集一張光譜最快只需18毫秒）[98]。該系統(tǒng)的發(fā)展為深入研究界面超快構(gòu)象變化和界面能量轉(zhuǎn)移等動力學(xué)行為提供了新的思路。利用具有特定能量的飛秒紅外脈沖選擇激發(fā)生物膜上蛋白質(zhì)的N-H基團，然后用飛秒和頻光譜監(jiān)控N-H基團的瞬態(tài)變化，本小組首次成功測出水環(huán)境下生物膜上蛋白質(zhì)N-H的振動能量馳豫速率（圖13）[99]。如圖13所示，WALP23分子的ssp光譜在t=?2.0 ps時只有 3314 cm?1處一個振動基態(tài)的特征峰。由于t=0 ps時泵浦光的激發(fā)導(dǎo)致一部分基態(tài)分子被激發(fā)到激發(fā)態(tài)，使得基態(tài)的分子布居數(shù)減小，基態(tài)峰的強度比沒有激發(fā)時要小。與此同時，3177 cm?1處也出現(xiàn)了一個源于振動激發(fā)態(tài)的新的特征峰。隨著弛豫時間的增加，振動激發(fā)態(tài)的能級布居數(shù)逐漸減少，激發(fā)態(tài)振動峰逐漸降低，同時基態(tài)振動峰也逐漸回歸到原來的強度。通過四能級模型的擬合與計算，獲得 WALP23分子 N-H伸縮振動的弛豫時間常數(shù)為1.70±0.05 ps。這個弛豫時間常數(shù)略低于非氫鍵作用環(huán)境下AcAla(H)OMe分子的弛豫時間常數(shù)(4 ps)，略高于二氯甲烷溶液中N-甲基乙酰胺分子的弛豫時間常數(shù)(1 ps)。而β-折疊結(jié)構(gòu)樣品中的馳豫時間則為0.9 ps。

在此基礎(chǔ)上，通過激發(fā) N-H基團，探測酰胺 I譜帶的瞬態(tài)變化，我們發(fā)現(xiàn) N-H到 C=O的振動能量傳遞存在兩種途徑：一種是直接的 NHCO耦合作用 (σNH-CO)；另一種是 N-H先馳豫到某中間態(tài)（記為X態(tài)），然后X態(tài)與C=O發(fā)生耦合作用 (σX-CO)（圖 14C）。系統(tǒng)研究表明 NH···O=C的氫鍵強弱決定N-H與C=O間兩種耦合途徑(σX-CO/σNH-CO)的比例：氫鍵越強，σX-CO耦合的比例越高。這一發(fā)現(xiàn)成功揭示了氫鍵作用影響膜蛋白能量傳遞途徑和速率的規(guī)律，同時也表明具有強氫鍵相互作用的蛋白質(zhì)分子中的振動模式存在明顯的能量耦合，因此目前理論計算中使用的非耦合近似處理似乎是不夠準(zhǔn)確的。以上實驗結(jié)果將有助于我們理解蛋白質(zhì)分子在變構(gòu)通訊過程中真實的動力學(xué)特征與反應(yīng)機理。

圖10.利用和頻振動光譜酰胺I譜帶和酰胺A譜帶監(jiān)控界面蛋白質(zhì)hIAPP的結(jié)構(gòu)演變過程。(A)hIAPP分子序列與實驗示意圖。(B)DPPG單層膜上hIAPP分子穩(wěn)態(tài)ssp光譜（非手性）與psp光譜（手性），以及酰胺I波段ssp光譜、酰胺I波段psp光譜、酰胺A波段psp光譜隨作用時間的變化。(C)譜峰強度隨作用時間的變化以及hIAPP在膜表面上結(jié)構(gòu)演變示意圖。圖片摘自文獻59，版權(quán)所有American Chemical Society。

圖11.(A)pH=6.7與(B)pH=11.9時POPC/POPC雙層膜中丙甲甘肽分子酰胺I波段的ppp光譜與 ssp光譜。圖片摘自文獻1，版權(quán)所有American Chemical Society。

V.結(jié)論與展望

圖12.pH值改變（由6.7變成11.9）后POPC/POPC雙層膜中丙甲甘肽分子1665 cm?1位置的 ppp偏振和頻信號與不同片段取向角度發(fā)生的變化。圖片摘自文獻1，版權(quán)所有American Chemical Society。

圖13.d-DPPG雙層膜/D2O界面上WALP23分子酰胺A譜帶的能量弛豫過程（泵浦 光頻率：3300 cm?1）。 (A)WALP23分子酰胺 A光譜隨泵浦弛豫時間的變化； (B)WALP23分子的N-H伸縮振動譜峰相對強度隨泵浦弛豫時間的變化；(C)弛豫能級示意圖。圖片摘自文獻99，版權(quán)所有John Wiley&Sons,Inc.。

本文中我們系統(tǒng)介紹了二階非線性和頻振動光譜在界面蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動力學(xué)方面的研究進展。和頻振動光譜可以作為一種表征界面蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、動力學(xué)與超快能量轉(zhuǎn)移的強有力技術(shù)。通過探測酰胺I波段，酰胺III波段與酰胺A波段的譜學(xué)特征，我們可以精確測定界面蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與取向。通過原位實時定點地監(jiān)控和頻振動光譜的依時變化，我們可以挖掘出界面上蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象和二級結(jié)構(gòu)的演變機制。這些分子層次上的信息，將有助于我們?nèi)胬斫饨缑娴鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)與動力學(xué)特征，闡明界面蛋白質(zhì)在跨膜、折疊、分子識別、變構(gòu)通訊等過程，揭示各種與蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)的神經(jīng)退化型疾病機制，進而為發(fā)展新藥物提供理論指導(dǎo)。和頻振動光譜技術(shù)近年來在我國發(fā)展迅速，并將在界面復(fù)雜體系的物理與化學(xué)問題的相關(guān)研究中發(fā)揮出越來越重要的作用。

致 謝

感謝國家自然科學(xué)基金 (21473177,21633007,21790350),國家重點研發(fā)計劃 (2017YFA0303500,2018YFA0208700),中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(WK2340000064),中國科學(xué)院(2016HSC-IU003),安徽量子信息技術(shù)先導(dǎo)項目(AHY090000)。

[1]Ye S J,Li H C,Wei F,et al.J Am Chem Soc,2012,134:6237-6243

[2]Wang H Y,Tao J,Shumay E,et al.Eur J Cell Biol,2006,85:643-650

[3]Chen X,Boughton A P,Tesmer J J G,et al.J Am Chem Soc,2007,129:12658-12659

[4]Outeiro T F.Nat Chem Biol,2011,7:581-582

[5]Bates G P.Science,2006,311:1385-1386

[6]Dobson C M.Nature,2003,426:884-890

[7]Dos Santos Cabrera M P,Arcisio-Miranda M,Gorjao R,et al.Biochemistry,2012,51:4898-4908

[8]Tang J,Signarvic R S,DeGrado W F,et al.Biochemistry,2007,46:13856-13863

[9]Hlady V,Buijs J.Curr Opin Biotech,1996,7:72-77

[10]Ye S J,Nguyen K T,Boughton A P,et al.Langmuir,2009,26:6471-6477

[11]Ye S J,Nguyen K T,Chen Z.J Phys Chem B,2010,114:3334-3340

[12]Zhu H,Snyder M.Curr Opin Chem Biol,2003,7:55-63

[13]Castellana E T,Cremer P S.Surf Sci Rep,2006,61:429-444

[14]Battle A R,Ridone P,Bavi N,et al.Biochim Biophys Acta,2015,1848:1744-1756

[15]Judge P J,Watts A.Curr Opin Biotech,2011,15:690-695

[16]Fenwick R B,van den Bedem H,Fraser J S,et al.Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111:E445-E454

[17]Coen M C,Lehmann R,Gr¨oning P,et al.J Colloid Interface Sci,2001,233:180-189

[18]Boxer S G,Kraft M L,Weber P K.Annu Rev Biophys,2009,38:53-74

[19]Li H,Xu B,Wang D,et al.J Biotechnol,2015,203:97-103

[20]Zhang W,Qing W,Ren Z,et al.Bioresour Technol,2014,172:16-21

[21]Yano Y F.J Phys.:Condens Matter,2012,24:503101

[22]Fotiadis D.Curr Opin Biotech,2012,23:510-515

[23]Van den Berg B,Clemons W M,Collinson I,et al.Nature,2004,427:36-44

[24]Vogeley L,Sineshchekov O A,Trivedi V D,et al.Science,2004,306:1390-1393

[25]Faller M,Niederweis M,Schulz G E.Science,2004,303:1189-1192

[26]Ashcroft F M.Nature,2006,440:440-447

[27]Khakh B S,North R A.Nature,2006,442:527-532

[28]Besenicar M,Macek P,Lakey J H,et al.Chem Phys Lipids,2006,141:169-178

[29]Devanathan S,Salamon Z,Lindblom G,et al.FEBS J,2006,273:1389-1402

[30]Salamon Z,Macleod H A,Tollin G.Biochim Biophys.Acta,1997,1331:131-152

[31]Seddon J M,Cevc G.Lipid Polymorphism:Structure and Stability of Lyotropic Mesophases of Phospholipids,Marcel Dekker,Inc:New York,1993

[32]Shen Y R.The Principles of Nonlinear Optics,John Wiley&Sons:New York,1984

[33]Zhuang X,Miranda P B,Kim D,et al.Phys Rev B,1999,59:12632–12640

[34]Wei X,Hong S C,Zhuang X W,Goto T and Shen Y R,Phys Rev E,2000,62:5160–5172

[35]Belkin M A,Shen Y R.Int Rev Phys Chem,2005,24:257–299

[36]Geiger F M.Annu Rev Phys Chem,2009,60:61–83

[37]Rivera C A,Fourkas J T.Int Rev Phys Chem,2011,30:409–443

[38]Shen Y R.Annu Rev Phys Chem,2013,64:129–150

[39]Wang H F,Velarde L,Gan W,et al.Annu Rev Phys Chem,2015,66:189–216