銅綠假單胞菌D-試驗(yàn)陽(yáng)性及陰性菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的差異性分析*

謝國(guó)艷，肖 敏

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院檢驗(yàn)科，上海 202150；2.解放軍第306醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，北京 100101)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一種條件致病菌，由于自身結(jié)構(gòu)及抗生素誘導(dǎo)作用，該菌可產(chǎn)生幾乎所有類型的β-內(nèi)酰胺酶[1]，感染后極易發(fā)生耐藥，成為臨床上重要的耐藥菌之一。筆者在日常工作中發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用紙片法(K-B法)對(duì)PA進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，當(dāng)亞胺培南與頭孢他啶紙片相距15～26 mm，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)D-試驗(yàn)陽(yáng)性現(xiàn)象(即亞胺培南誘導(dǎo)PA對(duì)頭孢他啶耐藥)，有研究[2]表明，此現(xiàn)象產(chǎn)生可能與亞胺培南誘導(dǎo)AmpC酶的大量產(chǎn)生有關(guān)，是否還存在其它原因？本研究針對(duì)D現(xiàn)試驗(yàn)陽(yáng)性及陰性的PA菌株，檢測(cè)其AmpC酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)，比較兩者的差異，探討產(chǎn)生D現(xiàn)象的PA株在臨床的發(fā)生率以及發(fā)生機(jī)制。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 386株非重復(fù)PA分離株，收集于本院2015年1～10月住院病人的送檢標(biāo)本，所有菌株均經(jīng)MicroScan-96全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定到種，菌株以甘油肉湯-20℃保存?zhèn)溆?。銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603購(gòu)自上海市臨檢中心。

1.2 試劑與儀器 MicroScan WalkAway-96全自動(dòng)微生物鑒定儀(西門(mén)子公司)，MIC藥敏試驗(yàn)為NC50板(西門(mén)子公司)，藥敏紙片為OXOID公司，MH平板為上海科瑪嘉公司。

1.3 方法

1.3.1 D試驗(yàn)：紙片擴(kuò)散法(K-B)[3]：將待測(cè)菌液配成0.5麥?zhǔn)蠁挝?，涂布于MH培養(yǎng)基，分別貼亞胺培南(10 μg)和頭孢他啶(30 μg)，兩片邊緣之間的距離為15～26 mm，35℃培養(yǎng)16～18 h。若頭孢他啶紙片的抑菌圈在靠近亞胺培南紙片一側(cè)出現(xiàn)截平現(xiàn)象時(shí)，則判為D試驗(yàn)陽(yáng)性。銅綠假單胞菌ATCC 27853為質(zhì)控菌株。

1.3.2 β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)的表型確證檢測(cè)：挑選D試驗(yàn)陽(yáng)性株與部分陰性株檢測(cè)。

1.3.3 MBLs的檢測(cè)：改良Hodge實(shí)驗(yàn)[4]：將肺炎克雷伯菌ATCC700603(指示菌)調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，再用生理鹽水1∶10稀釋后均勻涂布MH平皿，室溫放置10 min后，貼美羅培南(10 μg)紙片。挑取3～5個(gè)過(guò)夜生長(zhǎng)的待測(cè)菌，從紙片邊緣向外劃直線，35℃培養(yǎng)16～20 h，觀察指示菌有無(wú)出現(xiàn)向美羅培南紙片增強(qiáng)生長(zhǎng)現(xiàn)象，若增強(qiáng)生長(zhǎng)，即為MBLs陽(yáng)性。

1.3.4 AmpC酶檢測(cè)：均采用三維實(shí)驗(yàn)[5]，酶粗提液采用反復(fù)凍融法，AmpC酶采用的紙片為頭孢西丁(30 μg)，35℃培養(yǎng)24 h后，若在畫(huà)線處有大腸埃希菌的矢狀生長(zhǎng)則可確定AmpC酶陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 資料分析采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS12.0軟件包統(tǒng)計(jì)。

2結(jié)果

2.1 D試驗(yàn) 386株P(guān)A有132株為D-試驗(yàn)陽(yáng)性株，占34.2%，其中98株(74.2%)菌株為亞胺培南耐藥D1型，見(jiàn)圖1。34株(25.8%)菌株為亞胺培南敏感D2型，見(jiàn)圖2。

圖1 D-試驗(yàn)陽(yáng)性株 圖2 D-試驗(yàn)陰性株

2.2 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè) 132株D試驗(yàn)陽(yáng)性株和選取的100株D試驗(yàn)陰性株中，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的類型比較見(jiàn)表1。98株D1型和34株D2型菌株的產(chǎn)酶情況見(jiàn)表2。

表1 PA陽(yáng)性株與陰性株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的類型比較[n(%)]

注：*與D-菌株相比χ2=39.9，26.4，14.7，P<0.01。

表2 D1型株與D2型株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的類型比較[n(%)]

注：#與D2型菌株相比，χ2=6.1，3.9，P<0.05。

3討論通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D-試驗(yàn)陽(yáng)性的PA的發(fā)生率為34.2%，并存在著D1型和D2型兩種耐藥表型，其中以D1型為主，占74.2%，D2型占25.8%。比較兩種類型的D-試驗(yàn)陽(yáng)性株，兩者的總產(chǎn)酶率相差不大，但在產(chǎn)MBLs和AmpC酶方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：即D1型產(chǎn)MBLs顯著高于D2型，而D2型產(chǎn)AmpC酶顯著高于D1型。D1型表現(xiàn)為亞胺培南耐藥，而文獻(xiàn)報(bào)道[6]PA對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制多因由產(chǎn)金屬酶所引起，與D1型以產(chǎn)MBLs為主的結(jié)論相吻合，推測(cè)D1型菌株發(fā)生D-試驗(yàn)現(xiàn)象的原因可能與MBLs的產(chǎn)生有關(guān)。而D2型表現(xiàn)為亞胺培南敏感，主要產(chǎn)AmpC酶，推測(cè)產(chǎn)AmpC酶可能為D2型菌株發(fā)生D-試驗(yàn)現(xiàn)象的主要發(fā)生機(jī)制，與此現(xiàn)象產(chǎn)生可能與亞胺培南誘導(dǎo)AmpC酶的大量產(chǎn)生有關(guān)的觀點(diǎn)[2]相一致。

比較D試驗(yàn)陽(yáng)性株與陰性株在總產(chǎn)酶率、產(chǎn)MBLs和產(chǎn)AmpC酶方面的差異，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性株在三個(gè)方面均顯著高于陰性株，兩者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推測(cè)導(dǎo)致PA菌株發(fā)生D-試驗(yàn)現(xiàn)象的原因可能與MBLs和AmpC酶的大量產(chǎn)生有關(guān)。

PA是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，在醫(yī)院感染率居首位[7]，它能夠通過(guò)不同的機(jī)制對(duì)各類抗生素產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥，導(dǎo)致臨床治療PA感染過(guò)程中反復(fù)感染，難以治愈。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，先前應(yīng)用碳青霉烯類抗生素是碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌感染的危險(xiǎn)因子，因此，當(dāng)D-試驗(yàn)篩選出D-試驗(yàn)陰性株時(shí)，由于此類菌株產(chǎn)MBLs和AmpC酶的幾率較低，應(yīng)及時(shí)提示臨床盡量避免使用碳青霉烯類抗生素；而當(dāng)篩選出D-試驗(yàn)陽(yáng)性菌株，特別是D2型菌株時(shí)，由于此時(shí)菌株并未產(chǎn)生亞胺培南耐藥，應(yīng)及時(shí)提示臨床謹(jǐn)慎使用碳青霉烯類抗生素，延緩碳青酶烯類耐藥的PA的產(chǎn)生。

D試驗(yàn)陽(yáng)性PA株發(fā)生率較高，不容忽視，D-試驗(yàn)是一種簡(jiǎn)便的表型初篩試驗(yàn)，在日常工作開(kāi)展PA的D-試驗(yàn)是有必要的，可以指導(dǎo)臨床醫(yī)師更合理使用抗生素。

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