糖尿病腎病患者血清miR-135b水平檢測(cè)與疾病預(yù)后的相關(guān)性研究*

吳忠璟，陳亞鳳，高芳虹(?？谑袐D幼保健院檢驗(yàn)科，海口 570102)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病重要的微血管病變之一，以持續(xù)性蛋白尿、漸進(jìn)性腎功能損傷及血壓升高為特征，可導(dǎo)致慢性腎衰竭及患者死亡[1，2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性約含有19～24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過抑制或降解靶基因信使RNA在細(xì)胞增殖與分化、個(gè)體發(fā)育、激素分泌、腫瘤形成等過程中扮演重要角色[3，4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b參與了腎間質(zhì)纖維化過程、腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，亦可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究通過觀察DN患者血清miR-135b表達(dá)水平變化，并分析miR-135b與DN患者預(yù)后的關(guān)系，旨在為DN的早期治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年3月～2017年10月?？谑袐D幼保健院收治的2型糖尿病腎病患者158例作為研究對(duì)象(DN組)，其中男性86例，女性72例，年齡35～82(50.15±6.30)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②經(jīng)過腎活檢診斷為DN或臨床特點(diǎn)符合DN。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急慢性腎小球腎炎、尿路感染及其他腎臟疾病者；②伴有惡性腫瘤、肝腎功能衰竭及自身免疫性疾病者。另選擇同期來我院體檢正常健康者60例作為對(duì)照組，其中男性32例，女性28例，年齡34～78(48.93±6.25)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑盒購自美國Ambio公司，在ABI7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測(cè)：空腹抽取靜脈血3 ml置于未加抗凝劑的離心管中，于室溫2 500 r/min離心15 min，分2層，吸取上層血清400 μl轉(zhuǎn)移至1個(gè)EP管中，-80℃保存。PCR總反應(yīng)體系為15 μl，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。擴(kuò)增條件為：95℃10 min 1個(gè)循環(huán)，95℃15s，60℃ 60s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的閾值的經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-135b的相對(duì)表達(dá)水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.3.2 觀察指標(biāo)：包括年齡、性別、糖尿病病程、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、24h尿蛋白定量及估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)。

1.3.3 腎臟損傷評(píng)價(jià)：采用腎小球分級(jí)，間質(zhì)性纖維化和小管萎縮評(píng)分(IFTA)及間質(zhì)炎癥來評(píng)價(jià)腎臟損傷情況。終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)定義為eGFR<15 ml/(min·1.73 m2)或開始接受維持性腎臟替代治療。對(duì)于未達(dá)到腎臟終點(diǎn)的患者，最后一次隨訪數(shù)據(jù)作為他們的最終數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1 兩組血清miR-135b水平比較 DN組血清miR-135b水平為3.94±0.75，明顯高于對(duì)照組0.64±0.13，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.317，P<0.01)。

2.2 血清miR-135b水平與DN患者不同臨床指標(biāo)的關(guān)系 見表1。血清miR-135b表達(dá)水平在不同水平尿蛋白定量、Cr，BUN及eGFR中比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.971，5.105，5.924，7.409，均P<0.05)；而miR-135b在不同年齡、性別、糖尿病病程、BMI，F(xiàn)BG及HbA1水平中比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 DN患者不同腎臟病理損傷程度血清miR-135b水平比較 見表2。DN患者血清miR-135b水平與腎小球分級(jí)，IFTA及間質(zhì)炎癥均有關(guān)，且隨著腎臟病理損傷程度的增加，血清miR-135b水平升高，其中腎小球分級(jí)Ⅲ，Ⅳ的miR-135b水平高于Ⅰ，Ⅱ級(jí)，IFTA 2～3分的miR-135b水平高于0～1分，間質(zhì)炎癥1～2分的miR-135b水平亦高于0分，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.207，3.205，4.116，均P<0.05)。

2.4 血清miR-135b水平預(yù)測(cè)DN患者發(fā)生ESRD的價(jià)值 見圖1。158例DN患者中有64例在隨訪期間進(jìn)入ESRD，其血清miR-133b水平為5.39±1.26明顯高于未進(jìn)入ESRD組(3.46±0.68)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.157，P=0.025)。ROC曲線顯示，血清miR-135b水平預(yù)測(cè)DN患者發(fā)生ESRD的最佳截值取4.96時(shí)，其曲線下面積(area under curve，AUC)[0.912(95%CI：0.850～0.973)]最大，敏感度和特異度較高，為91.3%和87.5%。

2.5 血清miR-135b與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，DN患者血清miR-135b水平與尿蛋白定量、Cr，BUN，腎小球分級(jí)、IFTA及間質(zhì)炎癥呈正相關(guān)(r=0.504，0.396，0.438，0.475，0.351，0.559，均P<0.01)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.637，P<0.01)；而與年齡、性別、糖尿病病程、BMI，F(xiàn)BG及HbA1c無明顯相關(guān)(P>0.05)。

表1 血清miR-135b水平與DN患者不同臨床指標(biāo)的關(guān)系

表2 DN患者不同腎臟病理損傷程度血清miR-135b水平比較

圖1 血清miR-135b水平預(yù)測(cè)DN患者發(fā)生ESRD的ROC曲線

3討論microRNA是一種內(nèi)源性的非編碼微小RNA，廣泛存在于真核生物中，作為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成分，通過參與細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)而影響生物體的各項(xiàng)生理活動(dòng)[7，8]。已有研究證實(shí)，miR-135b具有促進(jìn)癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移作用，在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)[9，10]。近年來的研究表明，microRNA檢測(cè)對(duì)于DN的早期診斷及療效評(píng)估等方面具有重要的價(jià)值，未來以microRNA為靶點(diǎn)開發(fā)的藥物將有望應(yīng)用于DN的治療[11，12]。McClelland等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血清microRNA水平在DN患者中異常表達(dá)，miRNA不僅有助于我們了解DN復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，還在DN的診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)上有一定的指導(dǎo)價(jià)值。另有研究表明，microRNA與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在DN中的靶向調(diào)控作用有望作為DN的新型標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[14]。本研究中DN組血清miR-135b水平明顯高于對(duì)照組，血清miR-135b水平與蛋白尿定量、Cr，BUN及eGFR水平相關(guān)。提示血清miR-135b水平與DN患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可能參與DN的發(fā)生發(fā)展。

在DN的發(fā)生和發(fā)展過程中，改善腎臟損傷及早期干預(yù)是DN救治的關(guān)鍵。本研究采用腎小球分級(jí)、IFTA及間質(zhì)炎癥共3個(gè)指標(biāo)來評(píng)價(jià)腎臟損傷程度，結(jié)果顯示DN患者血清miR-135b水平與腎小球分級(jí)，IFTA及間質(zhì)炎癥均有關(guān)，且隨著腎臟病理損傷程度的增加，血清miR-135b水平明顯升高。應(yīng)用ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)血清miR-135b水平預(yù)測(cè)DN患者發(fā)生ESRD的敏感度和特異度較好。提示血清miR-135b水平與腎功能進(jìn)展及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)DN進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物。腎小球間質(zhì)性損傷可影響管球反饋平衡，加重腎小球?yàn)V過壓，繼而使腎小球上皮受損，最終導(dǎo)致疾病進(jìn)展及發(fā)生ESRD。本研究中ESRD患者血清miR-135b水平明顯高于非ESRD患者。推測(cè)高水平的miR-135b可產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化、小管萎縮和間質(zhì)炎癥。Spearman相關(guān)分析顯示，DN患者血清miR-135b水平與蛋白尿定量、Cr，BUN，腎小球分級(jí)，IFTA及間質(zhì)炎癥呈正相關(guān)，與eGFR水平呈負(fù)相關(guān)。這進(jìn)一步提示血清miR-135b水平與腎臟病理損傷程度及DN預(yù)后不良有關(guān)。既往研究顯示，血清microRNA水平在腎小管間質(zhì)損傷中明顯升高，而腎小管間質(zhì)損傷與DN患者腎臟預(yù)后不良顯著相關(guān)，由此推測(cè)microRNA可能參與DN患者的病情進(jìn)展[15]。

綜上所述，血清miR-135b水平在DN患者中呈高表達(dá)，且與DN患者腎臟損傷及預(yù)后有關(guān)，miR-135b對(duì)預(yù)測(cè)DN發(fā)生ESRD具有一定價(jià)值，有望為DN的靶向治療提供新的思路。但本研究為單中心的回顧性研究，今后尚需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] Huang YQ，Gou R，Diao YS，et al．Charlson comorbidity index helps predict the risk of mortality for patients with type 2 diabetic nephropathy[J]．J Zhejiang Univ Sci B，2014，15(1)：58-66．

[2] Morikawa S，Ito H，Watanabe K．Diabetic nephropathy[J]．Der Nephrologe，2012，53(10)：1195-1206．

[3] Yao ZY，Chen WB，Shao SS，et al．Role of exosome-associated microRNA in diagnostic and therapeutic applications to metabolic disorders[J]．J Zhejiang Univ Sci B，2018，19(3)：183-198．

[4] Pratap P，Raza ST，Abbas S，et al．MicroRNA-associated carcinogenesis in lung carcinomas[J]．J Cancer Res Ther，2018，14(2)：249-254．

[5] 何 鳳，周姍姍，關(guān)昌杰，等．微小RNA-135b調(diào)控Smad5在糖尿病腎病發(fā)病中的作用研究[J]．新醫(yī)學(xué)，2017，48(5)：317-322．

He F，Zhou SS，Guan CJ，et al．Effect of micro RNA-135b on the pathogenesis of diabetic nephropathy by regulating Smad5[J]．New Medicine，2017，48(5)：317-322．

[6] American Diabetes Association．Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J]．Diabetes Care，2012，35(Suppl 1)：S64-71．

[7] Moridikia A，Mirzaei H，Sahebkar A，et al．MicroRNAs：Potential candidates for diagnosis and treatment of colorectal cancer[J]．J Cell Physiol，2018，233(2)：901-913．

[8] Hershkovitz-Rokah H，Geva P，Salmon-Divon M，et al．Network analysis of microRNAs，genes and their regulation in diffuse and follicular B-cell lymphomas[J]．Oncotarget，2018，9(8)：7928-7941．

[9] Nezu Y，Hagiwara K，Yamamoto Y，et al．MiR-135b，a key regulator of malignancy，is linked to poor prognosis in human myxoid liposarcoma[J]．Oncogene，2016，35(48)：6177-6188．

[10] Hua K，Jin J，Zhao J，et al．MiR-135b，upregulated in breast cancer，promotes cell growth and disrupts the cell cycle by regulating LATS2[J]．Int J Oncol，2016，48(5)：1997-2006．

[11] Simpson K，Wonnacott A，F(xiàn)raser DJ，et al．MicroRNAs in diabetic nephropathy：from biomarkers to therapy[J]．Curr Diab Rep，2016，16(3)：35．

[12] Nassirpour R，Raj D，Townsend R，et al．MicroRNA biomarkers in clinical renal disease：from diabetic nephropathy renal transplantation and beyond[J]．Food Chem Toxicol，2016，98(Pt A)：73-88．

[13] McClelland A，Hagiwara S，Kantharidis P．Where are we in diabetic nephropathy：microRNAs and biomarkers[J]．Curr Opin Nephrol Hypertens，2014，23(1)：80-86．

[14] Figueira MF，Monnerat-Cahli G，Medei E，et al．MicroRNAs：potential therapeutic targets in diabetic complications of the cardiovascular and renal systems[J]．Acta Physiol(Oxf)，2014，211(3)：491-500．

[15] Bhatt K，Kato M，Natarajan R，et al．Mini-review：emerging roles of microRNAs in the pathophysiology of renal diseases[J]．Am J Physiol Renal Physiol，2016，310(2)：F109-F118．