中重度顱腦損傷并發(fā)腦梗死患者血清miRNA-124與miRNA-210表達的臨床意義*

程永紅，肖小平(.商洛市中心醫(yī)院檢驗科，陜西商洛 76000，.西安市第八醫(yī)院檢驗科，西安 7006)

外傷性腦梗死是顱腦損傷的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率超過10%，并且增加了顱腦損傷患者的病死率及致殘率。因此 ，阻止腦梗死急性期病情進展對疾病的預后具有重要意義 。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一類長約22bp的非蛋白質編碼的小分子RNA。研究證實miRNAs通過調控基因表達對細胞增殖、分化、凋亡等細胞行為起調控作用。人類20%～30%的蛋白質編碼基因的表達受到miRNAs調控，某些miRNAs在中樞神經系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育、信號傳導通路的調節(jié)以及神經保護等過程中發(fā)揮重要作用[1]。越來越多的證據(jù)表明，異常的miRNAs表達涉及到各種腫瘤、阿爾茨海默病、帕金森病、唐氏綜合癥、精神分裂癥和腦卒中[2]。本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測顱腦損傷后并發(fā)外傷性腦梗死患者血清miRNA-124和miRNA-210的表達，旨在探討外傷性腦梗死的發(fā)病機制，并為顱腦損傷并發(fā)腦梗死的預防和治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月～2016年12月在商洛市中心醫(yī)院和西安市第八醫(yī)院神經外科住院治療的中重度顱腦損傷患者57例，其中并發(fā)外傷性腦梗死患者22例(梗死組)，男性16例，女性6例，年齡37.2±16.9歲；未發(fā)生外傷性腦梗死患者35例(未梗死組)，男性26例，女性9例，年齡39.7±15.3歲。顱腦外傷患者均于傷后24h內入院。根據(jù)GCS評分及CT表現(xiàn)判定病情程度，其中輕型GCS 15～13分，中型GCS 12～9分，重型GCS 8～6分。所有患者均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準。外傷性腦梗死診斷標準：入院時頭顱CT或MRI檢查確定無腦梗死，而在住院治療期間出現(xiàn)腦梗死。梗死組GCS評分3～8分的病例數(shù)為9例，發(fā)生腦疝和低血壓病例數(shù)分別為14例和11例；而未梗死組發(fā)生上述風險因素的病例數(shù)分別為5例，5例和3例。采用Logistic回歸分析上述三種風險因素的結果顯示(χ2=0.263，P>0.05；χ2=28.76，P<0.05；χ2=23.27，P<0.05)，腦疝和低血壓是中重型顱腦損傷并發(fā)外傷性腦梗死的獨立危險因素(P<0.05)。

選取24例同期無任何腫瘤病史的健康體檢者作為對照組，男性16例，女性8例，年齡35.9±16.3歲。所有患者既往均無高血壓、心臟病、糖尿病或口服抗凝藥物的病史。各組的性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經我院倫理委員會批準，并得到所有研究對象的許可。

1.2 試劑和儀器 采用德國EME公司TC-8080型經顱多普勒超聲診斷儀檢測受試者大腦ACA，MCA及PCA的流速。RNA提取使用美國Invitrogen公司產品。PCR試劑盒采用TaqMall RNA Reverse Transcripts Kits。lightCycler熒光PCR儀采用德國Roche公司產品。

1.3 方法

1.3.1 研究方法：選擇患者的格拉斯哥昏迷(GCS)評分、腦疝及低血壓資料進行回顧性分析。腦疝診斷標準為中、晚期意識昏迷伴有一側或雙側瞳孔散大。未梗死組于入院后7天及梗死組于CT發(fā)現(xiàn)梗死后行經顱多普勒超聲測量大腦前動脈(ACA)、大腦中動脈(MCA)及大腦后動脈(PCA)的平均流速。采用德國EME公司TC-8080型經顱多普勒超聲(TCD)診斷儀檢測受試者大腦ACA，MCA及PCA的流速，探頭頻率2 MHz。受檢者檢查時，探頭置于顳窗，探頭涂上足夠的超聲耦合劑，探頭與皮膚保持一定壓力，以利超聲束穿透。取樣深度：ACA為55～65 mm，MCA為50～60 mm，PCA為60～70 mm。測量MCA時探頭與顳窗皮膚垂直，測量ACA及PCA時探頭分別指向顳前和顳后，與皮膚成55°～65°的夾角。

1.3.2 標本采集：所有患者在傷后6 h分別采集靜脈血，將采集到的血液在2 h內作如下處理：4℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清，4℃ 3 000 r/min進一步離心10 min，將所得的血清標本分裝于無RNA酶和DNA酶的凍存管中，-80℃保存。

1.3.3 miRNAs表達量測定：①RNA提取：采用mirVANA PARIS試劑盒提取總RNA。在冰上融化血清，吸取100 μl，加入等體積的變性液，渦旋混勻，在冰上孵育5 min；再加入等體積的酸/酚/氯仿，渦旋混勻1 min，冷凍離心5 min，重復此步驟三次，再與1.25倍體積的無水乙醇充分混合，過柱，洗柱2次，將所得的RNA用緩沖液稀釋；混勻后，加樣于1 g/ml瓊脂糖凝膠的樣品孔內進行電泳。電泳條件：70伏電壓電泳15 min。電泳后的瓊脂糖凝膠在紫外透射分析儀下觀察。若RNA在5s，18s和28s條帶清晰可見，表示RNA 可用于反轉錄。②RNA純度檢測：根據(jù)提取總RNA大概量稀釋(用10 mmol/L Tris·HCl pH7.0稀釋)到適當濃度范圍，再用紫外分光光度計測定260 nm和280 nm波長下的光密度值。若A260nm/A280nm的比值在1.7～2.0間則考慮總RNA溶液無雜質。將合格的總RNA于-80℃保存?zhèn)溆?。③RNA反轉錄：根據(jù)TaqMall microRNA Reverse Transcripts Kits操作說明書進行RT-PCR。采用β‐actin作為內對照，用pfimer5軟件設計引物，miRNA-210引物序列為：正義鏈：5’-GCCCATCCTCAAATACAAAGC-3’，反義鏈：5’-GGTCCTGAACACAAAATGAGC-3’，擴增產物大小310 bp。miRNA-155的引物序列為：正義鏈：5’-TTAATGCTAATCGTGACT-3’，反義鏈：5’-ACCTGAGAGTAGACCAGA-3’，產物長度325bp。β-actin的引物序列為：正義鏈：5’-ATGTCACGCACGATTTCC-3’，反義鏈：5’-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3’，產物長度560 bp。每個樣品取3 μl反轉錄，PCR反應體系如下：10 μl 2×Taqman通用的PCR預混物，1 μl 20×miRNA特異性引物，1.33 μl cDNA，7.67 μl水；反應條件：95℃變性10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，50個循環(huán)，置于4℃結束反應。在擴增體系中，內參照β‐actin mRNA分別與miRNA-210，-124在同一體系中共同擴增。④miRNAs表達量計算：將擴增產物進行電泳。電泳后，在圖像處理系統(tǒng)上分析、計算，得出miRNA-210，-124，β-actin的光密度，以β-actin的光密度為參考物，求出miRNA-210，-124光密度的變化值(△Ct)，以2-△Ct得到miRNA-210，-124相對表達量。

2結果

2.1 各組ACA，MCA及PCA的平均流速比較 見表1。ACA，MCA及PCA在未梗死組的平均流速與對照組比較明顯增快，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.23，13.10，13.16，均P<0.01)。ACA，MCA及PCA在梗死組的平均流速與未梗死組及對照組比較明顯減慢，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.30，12.67，12.09；t=11.37，11.52，11.09，均P<0.01)。

2.2 各組血清miRNA-210，miRNA-124表達比較 見表1。血清miRNA-124，miRNA-210在梗死組和未梗死組的表達分別與對照組比較明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(t=35.37，36.93；t=22.99，23.67，均P<0.01)。兩標志物在梗死組的表達高于未梗死組，差異有統(tǒng)計學意義(t=23.27，25.12，均P<0.01)。

2.3 相關性分析 血清miRNA-124，miRNA-210在梗死組的表達呈正相關性(r=0.629，均P<0.01)。兩標志物分別與梗死組ACA，MCA及PCA的平均流速有負相關性(r=-0.653，-0.620，-0.613，均P<0.01；r=-0.679，-0.656，-0.637，均P<0.01)，而分別與未梗死組ACA，MCA及PCA的平均流速呈正相關性(r=0.640，0.596，0.607，均P<0.01；r=0.676，0.625，0.638，均P<0.01)。

表1 各組腦血清參數(shù)及血清miRNA-210，miRNA-124水平比較

注：ACA：大腦前動脈；MCA：大腦中動脈；PCA：大腦后動脈；miRNA-124：微小RNA-124；miRNA-210：微小RNA-210。

3討論研究發(fā)現(xiàn)，在顱腦損傷6 h后的大鼠大腦皮質中存在136個miRNAs表達，其中13個表達上調兩倍以上，14個表達下調兩倍以上[1]；近年來在卒中患者及動物模型的血清和腦組織中也檢測到miRNAs的表達[3]。創(chuàng)傷性顱腦損傷常伴有腦疝、低血壓及其周圍器官水腫等，外傷性腦梗死也是其并發(fā)癥之一。顱腦損傷后腦血管受到壓迫或牽拉而引起痙攣或管腔變狹窄導致其供血區(qū)域缺血、缺氧，這種變化不能及時緩解可能導致外傷性腦梗死的發(fā)生[4]。彭彬等[5]通過構建阻塞小鼠大腦中動脈模型來研究miRNAs的表達，結果發(fā)現(xiàn)缺血1h 以及再灌注24，48 h的血漿和腦組織 miRNAs水平呈現(xiàn)顯著的表達差異。Sun等[6]也通過相似的實驗研究miRNA-124對氧氣和葡萄糖剝奪后誘導細胞凋亡相關蛋白的影響，結果發(fā)現(xiàn)缺血區(qū)域miRNA-124水平較未缺血區(qū)域顯著升高。現(xiàn)在更多的研究證明循環(huán)中存在著穩(wěn)定的miRNAs。Patrik等[7]研究認為血漿miRNA-124水平可以反映和監(jiān)測早期缺血性腦損傷的病程進展。本研究通過對外傷性腦梗死患者的研究發(fā)現(xiàn)，梗死組、未梗死組患者血清miRNA-124表達顯著高于對照組，提示顱腦損傷患者腦血管內皮細胞可能存在缺血、缺氧；進一步的研究顯示梗死組、未梗死組miRNA-124的表達存在顯著性差異，提示腦血管的缺血、缺氧未能及時得到糾正可能是導致腦梗死發(fā)生的重要因素。以上研究顯示miRNA-124在缺血性腦卒中的發(fā)病機制和病理變化過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。提示miRNA-124可能會成為腦卒中的診斷和治療標志物。

局部腦血管內皮細胞在急性腦缺血后容易發(fā)生死亡導致血腦屏障的破壞，加重神經細胞損傷，使腦梗死面積增大。Lou等[8]通過構建小鼠缺血性腦損傷模型的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-210的過表達與小鼠腦缺血后新生血管生成有關。Zeng等[9]的報道認為miRNA-210過表達促進缺血小鼠受損大腦的新生血管生成，增加神經細胞的數(shù)量。他們進一步的研究顯示miR-210水平可能與小鼠缺血性腦損傷的發(fā)病機制和修復過程有關。目前諸多研究表明[10]，在正常的血管內皮細胞中miR-210呈過表達，其通過下調靶基因eph-rinA3的表達促進血管新生。miRNA-210在卒中中的作用機制可能為miRNA-210的過表達上調內皮細胞Notch1信號通路，誘導內皮細胞遷移并在血管基底膜上形成毛細血管樣結構，該過程促進腦梗死后腦組織的修復，預防缺血性神經元死亡[8]。本研究結果顯示腦梗死組、未梗死組患者血清中miRNA-210表達顯著高于對照組，顯示創(chuàng)傷性顱腦損傷患者可能存在腦組織的缺血和缺氧。梗死組miRNA-210的過表達提示該標志物可能參與梗死組織的自我修復過程。因此筆者認為miRNA-210可作為診斷和治療缺血性腦卒中的潛在靶點。

經顱多普勒超聲(TCD)技術通過檢測顱腦損傷患者顱內血流動力學變化，早期預測顱腦損傷患者的顱內壓增高狀況。并依據(jù)其變化進行有效治療，防止腦損害的加重，改善患者的預后。當TCD顯示腦血流速度輕度增快時，提示傷情輕，預后良好；當TCD顯示血流速度明顯增高，提示顱內壓開始增高；當TCD顯示平均血流速度明顯降低時，提示顱內壓急劇增高，腦循環(huán)郁滯，腦血流減少，發(fā)生腦梗死的風險增大且預后差[11]。本研究結果顯示未梗死組ACA，MCA及PCA的平均流速增快，提示該組患者顱內壓開始增高。梗死組梗死側的血流速降低，推測腦損傷可能加重，緩慢的血流速度容易引起血栓形成并促進腦梗死病程的進展。相關性分析的研究顯示梗死組患者血清miRNA-210，miRNA-124表達與腦血流三項指標具有顯著相關性，提示兩項分子標志物與顱腦損傷及其并發(fā)腦梗死的病變過程密切相關。因此，通過研究血清miRNA-210，miRNA-124與外傷性腦梗死疾病中的作用，可豐富人們對該病發(fā)病機制的認識，并可能為外傷性腦梗死的早期診斷及治療提供一條新的思路。

參考文獻：

[1] 孫婷怡，劉 良，劉子龍．MicroRNA在創(chuàng)傷性腦損傷的研究進展[J]．中國法醫(yī)學雜志，2013，28(6)：484-487．

Sun TY，Liu L，Liu ZL．Advances of microRNA in traumatic brain injury[J]．Chinese Journal of Forensic Medicine，2013，28(6)：484-487．

[2] 何三軍，韓亦非．陜西省漢族人群miR-149基因多態(tài)性與缺血性腦卒中相關性研究[J]．現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2013，28(6)：32-34，38．

He SJ，Han YF．Association between miR-149 polymorphism and ischemic stroke in Han population in Hanzhong of Shaanxi[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2013，28(6)：32-34，38．

[3] Guo D，Liu J，Wang W，et al．Alteration in abundance and compartmentalization of inflammation-related miRNAs in plasma after intracerebral hemorrhage[J]．Stroke，2013，44(6)：1739-1742．

[4] 程 京．血必凈聯(lián)合前列地爾治療腦梗死急性期的療效及安全性觀察[J]．中國實用神經疾病雜志，2014，17(7)：57-60．

Cheng J．Effect and safety of Xuebijing combined alprostadil in the treatment of acute period of cerebral infarction[J]．Chinese Journal of Practical Neurous Diseases，2014，17(7)：57-60．

[5] 彭 彬，吳大玉，孫象蘭，等．急性腦梗死早期血中miRNAs水平與腦側支循環(huán)建立的關系[J]．中風與神經疾病雜志，2016，33(2)：100-103．

Peng B，Wu DY，Sun XL，et al．The correlation between miRNAs levels and collateral pathway in the patients with acute cerebral infarction[J]．Journal of Apoplexy and Nervous Diseases，2016，33(2)：100-103．

[6] Sun Y，Gui H，Li Q，et al．MicroRNA-124 protects neurons against apoptosis in cerebral ischemic stroke[J]．CNS Neuroscience & Therapeutics，2013，19(10)：813-819．

[8] Lou YL，Guo F，Liu F，et al．miR-210 activates notch signaling pathway in angiogenesis induced by cerebral ischemia[J]．Molecular and Cellular Biochemistry，2012，370(1/2)，45-51．

[9] Zeng LL，He XS，Liu JR，et al．Lentivirus mediated overexpression of microRNA-210 improves long-term outcomes after focal cerebral ischemia in mice[J]．CNS Neuroscience & Therapeutics，2016，22(12)：961-969．

[10] 靳蘭潔，舒 適，周 爽．miR-210與缺血性腦卒中的最新研究進展[J]．卒中與神經疾病，2015，22(4)：256-257．

Jin LJ，Shu S，Zhou S．The latest research progress between miR-210 and ischemic stroke[J]．Stroke and Nervous Disease，2015，22(4)：256-257．

[11] 李躍群，宋國紅，劉尚偉，等．經顱多普勒超聲診斷重型顱腦損傷患者腦死亡的應用分析[J]．中華行為醫(yī)學與腦科學雜志，2016，25(5)：442-445．

Li YQ，Song GH，Liu SW，et al．Application of transcranial doppler ulteasonograpy on brain death in severe craniocerebral injury[J]．Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science，2016，25(5)：442-445．