隱球菌腦膜炎患者外周血單個核細胞PILRα升高及意義*

李騰達，劉 鵬，龍曙萍，劉 云，黃元蘭，張薇薇，郭 杰，谷明莉，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院，上海 200433；2.解放軍455醫(yī)院，上海 200052)

新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)是一種機會性致病真菌，常經(jīng)下呼吸道入侵機體，當機體由于腫瘤治療、移植、人類免疫缺陷病毒感染等而致免疫力低下時，隱球菌可從肺部入侵血液，經(jīng)血腦屏障到達腦部形成隱球菌腦病，威脅患者生命[1]。在隱球菌病中固有免疫巨噬細胞M1亞型在抵抗真菌感染中起到了重要作用，其主要產(chǎn)生IL-1，IL-6和TNF-α等細胞因子，可促進機體的Th1細胞分化及TNF-α，IFN-γ等細胞因子的產(chǎn)生[1～4]。NK細胞作為一種重要的固有免疫淋巴細胞，在隱球菌病中亦發(fā)揮了重要作用，可通過穿孔素介導(dǎo)的細胞毒作用殺傷隱球菌，該作用能夠被IL-12促進[5，6]。

II型成對免疫球蛋白樣受體(paired immunoglobin-like type 2 receptor alpha，PILRα)是一種免疫抑制受體，表達于粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等細胞上[7，8]。該蛋白包含兩種能夠激活髓細胞抑制作用的免疫酪氨酸受體抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)，可識別單純皰疹病毒1等配體[7，8]。研究表明PILRα與NK細胞結(jié)合可提高其IFN-γ產(chǎn)量與細胞毒性，有利于實現(xiàn)NK細胞功能[8]，亦有cDNA微陣列分析顯示PILRα可作為巨噬細胞I亞型(M1)的新型標志性分子[9]，意味著PILRα可能參與了M1細胞相關(guān)的免疫炎癥作用。而M1，NK細胞等固有免疫細胞在隱球菌病中發(fā)揮了重要作用?；诖?，本文對PILRα在新型隱球菌腦病中表達情況進行研究，初步探討其作用機制，進而為隱球菌腦病的診治提供新的治療靶點。

1材料和方法

1.1 研究對象 收集2014年5月～2016年11月于長海醫(yī)院診斷為隱球菌腦膜炎患者作為實驗組，診斷標準為患者腦脊液新型隱球菌染色或培養(yǎng)陽性，患者平均年齡37.21±6.93歲，男性11例，女性19例。30例同期體檢的健康個體為對照組，平均年齡38.12±7.08歲，男女比例為2∶3，兩組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會批準，所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 Ficoll (Sigma公司)，ELISA試劑盒及抗體(ThermoFisher公司)，PCR試劑盒(Taraka公司)，Trizol(Thermo公司)，酶標儀(Thermo公司)，PCR儀(ThermoFisher公司)。

1.3 方法

1.3.1 外周血血漿及PBMCs分離：收集2～3 ml受試對象外周血裝入抗凝管，3 000 r/min離心10 min分離得到血漿，用于細胞因子檢測，待測血漿儲存于-80℃。將血細胞以PBS稀釋后加入到Ficoll試劑進行密度梯度離心，收集中間白膜層，并以約5倍體積的PBS洗兩次，以2 490 r/min離心10 min，得到的沉淀即為PBMCs，將細胞置于凍存盒中于-80℃放置2～3天后，轉(zhuǎn)移到液氮長期保存。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄及PCR檢測PBMCs中PILRα的表達情況：每106個細胞加入1 ml Trizol 進行PBMCs總RNA的抽提，依次加入氯仿、異丙醇、乙醇進行提取純化，最后用無RNA的雙蒸水溶解RNA，于56℃，水浴15 min，濃度及純度符合檢測標準的RNA樣本可用于PCR測定，測定方法按照PCR試劑盒進行。

1.3.3 ELISA法檢測血漿細胞因子：按照ELISA試劑盒操作說明對PILRα，IL-1，IL-6，IFN-γ，TNF-α等細胞因子進行檢測定量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 以獨立樣本t檢驗進行兩組間計量資料的比較，采用Pearson相關(guān)性系數(shù)表示兩變量間的關(guān)系，檢驗水準為0.05。分析軟件為Graph Prism 6.0。

2結(jié)果

2.1 實驗組與對照組PILRα的表達情況 實驗組與對照組PBMCs中PILRα的mRNA相對表達量為2.49±0.74 vs 1.77±0.69(t=3.898，P=0.000 3)；實驗組與對照組血漿中PILRα的蛋白表達量分別為33.81±10.21 ng/ml vs 20.01±6.74 ng/ml(t=6.178，P<0.000 1)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 實驗組與對照組相關(guān)免疫分子的表達 見表1。與對照組比較，實驗組血漿中IL-1，IL-6蛋白表達水平增高，IFN-γ表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.74，10.13，4.720，均P<0.05)，TNF-α，IL-12，IL-4的蛋白表達水平在實驗組與對照組不具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=0.858 5，1.276，0.266 3，均P>0.05)。

表1 實驗組與對照組Th1/Th2細胞相關(guān)免疫分子表達的比較

2.3 實驗組PILRα與細胞因子Pearson相關(guān)性分析 實驗組血漿中PILRα的蛋白表達水平與相關(guān)細胞因子的相關(guān)性分析顯示，PILRα與IL-1，IL-6，IFN-γ呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.456，0.521，0.467，均P<0.05)，與其他細胞因子不具有相關(guān)性(TNF-α：r=0.237，P>0.10；IL-12：r=0.311，P>0.05；IL-4：r=0.256，P>0.10)。

3討論新型隱球菌是一種普遍存在于外界環(huán)境中的條件致病真菌，其主要依賴于毒力因子多糖莢膜、胞壁黑色素等來抵抗外界射線、溫度等壓力[1，10]。當機體免疫功能缺陷時，其可通過細胞外分泌形式從肺部巨噬細胞逃逸，經(jīng)特洛伊木馬現(xiàn)象擴散到中樞神經(jīng)形成感染病灶致隱球菌腦病[1，11]。目前隱球菌病主要發(fā)生于服用免疫抑制藥物患者、免疫細胞功能缺陷病人、腫瘤、器官移植及肝病患者等[11]。在機體抵抗隱球菌的免疫過程中，人體第一道固有免疫屏障的肺泡巨噬細胞發(fā)揮了重要作用，M1型巨噬細胞可分泌IL-1，IL-6等因子，進而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生Th1樣反應(yīng)及IFN-γ等細胞因子的分泌，同時M1可通過Th1反應(yīng)促進真菌殺傷性NO的產(chǎn)生，殺死細胞內(nèi)吞噬的真菌[1～4]。NK細胞亦是機體重要免疫細胞，其在隱球菌感染中亦發(fā)揮了重要作用，在試管實驗中，NK細胞能抑制新型隱球菌的生長，而在小鼠模型中其可通過一系列細胞活動誘導(dǎo)病菌的免疫清除，在人體中NK細胞可通過穿孔素作用直接殺死新型隱球菌，以防止其進一步擴增及感染[5，6]。

PILRα是一種轉(zhuǎn)膜受體，由303個氨基酸組成，可識別O-糖基化黏蛋白受體例如PILR-相關(guān)的神經(jīng)蛋白(PANP)，神經(jīng)元分化和增殖因子-1(NPDC1)和膠原凝素-12(COLEC-12)，表達于髓細胞包括粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等[7，8]。研究表明PILRα-Ig可結(jié)合于人類NK細胞自然細胞毒性受體(natural cytotoxicity receptors，NCR)NKp44，NKp46等，可通過促進細胞殺傷作用和提高IFN-γ產(chǎn)量來實現(xiàn)NK細胞功能[8]。cDNA微陣列芯片分析顯示，PILRα可作為M1的新型標志分子，意味著其可能參與了M1相關(guān)免疫活動[9]。在類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中，PILRα表達增高且與炎癥細胞浸潤程度相關(guān)[12]，證明PILRα在炎癥反應(yīng)中起到了重要作用。綜上所述M1與NK細胞在新型隱球菌病的免疫活動中的重要性，PILRα與M1，NK細胞之間的關(guān)聯(lián)性及其在炎癥反應(yīng)中的作用，本研究假設(shè)PILRα在隱球菌感染免疫過程中可能亦發(fā)揮了重要作用。研究結(jié)果表明PILRα在隱球菌腦膜炎患者外周血單個核細胞中表達升高，且與IL-1，IL-6，IFN-γ呈正相關(guān)，表明PILRα可能參與了隱球菌病的免疫病理及炎癥過程，是該病潛在的靶點。但值得注意的是，本研究樣本量不足，尚需進一步擴大樣本量，并進行深入的PILRα機制性探索以明確其具體作用機理。

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