慢性粒細胞白血病患者骨髓單個核細胞中CaMKⅡγ在疾病不同階段的表達及分子機制*

張文靜，鄭維威，宋闿迪，朱俊鋒，王保龍

(1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院a.檢驗科；b.血液科，合肥 230000；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科，安徽蚌埠 233000)

慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，其主要特征是形成bcr-abl融合基因和費城染色體，并伴有9號和22號染色體的異位[1，2]。鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)是一種多功能蛋白酶， 包括α，β，γ和δ 4種亞基，近年的研究發(fā)現CaMKⅡγ與白血病有著密切聯系，是小分子化合物小檗胺抗白血病作用的分子靶標[3，4]。本研究通過檢測59例不同時期慢粒患者CaMKⅡγ的表達，并初步探討其分子機制，為慢粒的分子診斷和治療提供依據和思路。

1材料與方法

1.1 研究對象 59例CML病例為2017年1月～2018年1月的門診或住院患者，年齡18～76歲。其中慢性期18例，加速期21例，急變期20例。慢粒的診斷根據《血液病診斷及療效標準》進行[5]。慢粒細胞系來源于本院中心實驗室保存，復蘇待用。RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購于上海生工生物工程有限公司；胎牛血清購于Biological Industries；一抗：β-catenin購于CST；p- CaMKⅡγ，CaMKⅡγ抗體購于santa公司，GAPDH購于康成生物；二抗：購于康成生物；PVDF膜購于BIO-RAD，免疫共沉淀磁珠購自北京北方同正生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：所用的慢粒細胞系均培養(yǎng)于含有10 ml/dl胎牛血清，1 g/dl青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5 g/dl CO2中。

1.2.2 骨髓PBMC的分離：抽取CML患者骨髓2～5 ml，室溫下加入等體積的PBS，輕輕吹打混勻。將稀釋后的骨髓緩慢加入Ficoll液面，22℃，2 500 r/min離心20 min，離心后從管底至液面分四層。小心吸取單個核細胞層，加入3倍的PBS，洗兩次。將分離后的PBMC轉入新的EP管中，裂解蛋白，-80℃保存。

1.2.3 Western blot檢測p-CaMKⅡγ，CaMKⅡγ，β-catenin的表達水平：收集細胞，冷PBS洗2遍，用M-PER(PIERCE)裂解液冰上裂解20 min，4℃條件下以14 000 r/min離心15 min，提取上清總蛋白。取等量蛋白樣品，SDS-PAGE后將分離的蛋白質轉移至PVDF膜上，用5 g/dl脫脂奶粉封閉后，加入按相應比例稀釋的二抗，4℃孵育過夜。經TBST 洗膜除去過量的一抗，然后加入二抗，室溫孵育2 h。然后進行曝光顯影，以GAPDH為內參照。

1.2.4 免疫共沉淀：擴細胞達到1×108/L，加入500 μl細胞裂解緩沖液充分裂解(含蛋白酶抑制劑)，取少量裂解液用于Western blot分析，剩余裂解液加1 μg相應的抗體，4℃孵育過夜；將預處理過的10 μl protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4℃孵育6 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；免疫沉淀反應后，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3～4次；最后加入15 μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min用SDS-PAGE進行鑒定。

2結果

2.1 慢粒細胞系p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的表達情況 本研究用Western blot對K562，K562/ADR，Kcl-22，Kcl-22M，KU812和KBM5六種常見的慢粒細胞系p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的表達水平進行了檢測，結果顯示，Kcl-22和KU812的p-CaMKⅡγ表達水平較高，見圖1。

2.2 CML慢性期和急變期p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的表達情況 本研究對59例CML患者骨髓進行了p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的檢測，結果顯示，CML慢性期患者p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ的表達較低，甚至不表達，急變期患者p-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ高表達，見圖2，圖3。通過比較p-CaMKⅡγ/GAPDH比值，結果發(fā)現，加速期和急變期p-CaMKⅡγ/GAPDH比值高于慢性期，差異具有統(tǒng)計學顯著性意義(P=0.027和0.018)。

圖1 六種慢粒細胞系p-CaMKⅡγ，CaMKⅡγ和β-catenin的表達情況 圖2 慢粒慢性期患者p-CaMKⅡγ，CaMKⅡγ和β-catenin的表達情況

圖3 慢粒急變患者p-CaMKⅡγ，CaMKⅡγ和β-catenin的表達情況

2.3 CaMKⅡγ引起慢粒急變的分子機制研究 本研究對一個經典的白血病干細胞分子標記物β-catenin進行了同步檢測，結果發(fā)現，無論是慢粒細胞系還是CML患者骨髓樣本，β-catenin與CaMKⅡγ的表達幾乎是同步的，進一步通過免疫共沉淀結果也顯示，在慢粒細胞系K562中，CaMKⅡγ和β-catenin存在相互作用。詳見圖1，圖2，圖3，圖4。

圖4 K562細胞CaMKⅡγ和β-catenin的相互作用

3討論CML是骨髓造血干細胞惡性增殖疾病，其特點是Ph染色體的形成，在大多數CML體內可檢測出BCR-ABL融合基因，通過編碼酪氨酸激酶影響細胞分化[6]。 臨床上在治療CML時的一線藥物有伊馬替尼和達沙替尼，其中伊馬替尼的應用最為廣泛，已成為CML患者的常用藥物之一。BCR/ABL基因突變引起ABL激酶氨基酸改變，通過直接阻斷伊馬替尼與ABL激酶的結合或者妨礙ABL激酶失活構象的形成而干擾藥物與靶位點的結合，最終導致耐藥的發(fā)生[7]。

β-catenin是Wnt信號轉導通路中的核心因子，它承接上游的信號，也將信號傳遞至基因表達，幫助改變細胞的生長活性。研究發(fā)現，β-catenin可參與介導60多種基因表達，其中絕大多數為原癌基因，包括c-myc，cylin D1等靶基因，它們被β-catenin異常激活后，導致具有分化潛能的細胞不可控制地分化，在血液系統(tǒng)則可表現為造血干細胞異?？寺≡鲋常M而產生白血病細胞[8]。

急變期是CML的最后階段，這一階段病情更為兇險，治療難度更大，其分子機制依然不是十分清楚。大量的研究表明，白血病干細胞(LSC)的自我更新和復制是CML慢性期過渡到急變期的關鍵分子[9，10]。之前有研究表明，CaMKⅡγ在CML干細胞中被大量激活，同時激活了β-catenin[11，12]。因此我們推測，CaMKⅡγ可能在CML慢性期至急變期是至關重要的調節(jié)分子。本研究結果顯示，CaMKⅡγ在CML慢性期至急變期發(fā)揮重要作用，其表達可能與β-catenin的激活有關，且根據免疫共沉淀的結果也發(fā)現，CaMKⅡγ與β-catenin存在相互作用，但其確切分子機制尚需要更多的實驗加以證明。

綜上所述，CaMKⅡγ在慢粒細胞系和慢粒加速期和急變患者中呈現高表達，其分子機制可能與β-catenin的激活有關，這一研究結論將為CML的分子診斷提供重要依據。

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