重金屬污染對稻田共生黑斑蛙毒性影響研究

何志剛 伍遠(yuǎn)安* 王冬武 徐永福, 李金龍 陳建國

（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長沙，410153；2.南縣豐年生態(tài)黑斑青蛙養(yǎng)殖有限公司，湖南益陽，413200）

日益嚴(yán)重的環(huán)境污染與當(dāng)前黑斑蛙種群數(shù)量急劇銳減有密切關(guān)系。不僅殘留的除草劑和殺蟲劑對黑斑蛙造成毒害，重金屬污染對黑斑蛙造成的毒害亦極為嚴(yán)重。鑒于黑斑蛙等蛙類獨特的生活史和各發(fā)育階段的皮膚均具高滲透性，重金屬極易進入其體內(nèi)，進而對該類動物造成毒害這一特點，學(xué)界普遍認(rèn)為黑斑蛙等蛙類胚胎及幼體的存活狀況能夠敏感地反映水質(zhì)，可用于評價和控制工業(yè)排放物，是監(jiān)測水質(zhì)的適宜前哨物種之一。黑斑蛙由于其皮膚的高滲透性、水陸兩棲等生物學(xué)特性，對環(huán)境污染極其敏感，其種群的變化與環(huán)境污染物有密切的關(guān)系。黑斑蛙皮膚具有滲透水分和交換氣體的能力，其卵膜也具有半滲透性。黑斑蛙蝌蚪生活在水環(huán)境中，化學(xué)污染物可以通過水中積累對其產(chǎn)生脅迫。植物性水環(huán)境致使水生植物對污染物的富集放大作用通過食物鏈對黑斑蛙的正常發(fā)育和生存產(chǎn)生了很大作用。水環(huán)境周圍的一些小型動物通過食物鏈積累污染物，變態(tài)后的黑斑蛙多數(shù)食用這些動物，通過食物鏈進一步放大致使中毒。

稻田是黑斑蛙長期自然生存的環(huán)境之一，稻田重金屬污染對黑斑蛙的早期發(fā)育具有明顯的影響。這種影響主要表現(xiàn)為能使處于孵化期和開口期的胚胎致死（致死率隨濃度的升高而升高）以及影響蝌蚪的正常發(fā)育（發(fā)育緩慢及畸形）。隨著我國化工業(yè)的迅猛發(fā)展，化工業(yè)廢料所造成的環(huán)境污染也愈來愈嚴(yán)重。某些廢料中含有大量的重金屬離子，如果對這些廢料不加處理直接排入水中，將會對包括黑斑蛙在內(nèi)的所有水生生物產(chǎn)生影響。這不僅不利于漁業(yè)發(fā)展，并且重金屬離子通過生物鏈的級聯(lián)放大作用逐級傳遞并逐漸累積，將會對終極消費者人類產(chǎn)生極大的危害。

一、重金屬的毒性機理

動物生長發(fā)育本身需要礦物元素 （如Cu2+、Zn2+、Mn2+等），過量吸收重金屬才會有害。重金屬的毒性機理較為復(fù)雜，已提出的毒性機理包括離子及分子模擬、干擾細(xì)胞黏附和通信、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、遺傳毒性（DNA損傷）、細(xì)胞周期紊亂等。目前 Cd2+、Pb2+、Cu2+等重金屬對蛙蟾類的毒害，多是從氧化應(yīng)激角度開展的研究，過量的重金屬能導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，這些活性氧自由基可以引起DNA單鏈或雙鏈的斷裂、生物大分子和脂質(zhì)過氧化、膜脂質(zhì)過氧化及酶失活等，引起機體氧化應(yīng)激，進而引起一系列生理生化代謝紊亂，導(dǎo)致傷害發(fā)生，甚至死亡。另外，許多重金屬能與蛋白質(zhì)、酶、谷胱甘肽等中所含的SH基團發(fā)生作用，形成牢固的硫醇基，從而使一些物質(zhì)的功能受到抑制，破壞細(xì)胞的基本代謝。重金屬進入蛙體后，同時或先后作用于神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和腎臟等“要害”器官，即產(chǎn)生多系統(tǒng)性、多器官性的毒害作用。

目前重金屬污染對黑斑蛙毒性影響的研究多是采用急性毒性試驗，雖然短期毒理測試較快、簡便、費用低，但忽略了重金屬的積累特性及其毒性的累積效應(yīng)。暴露時間的長短對試驗結(jié)果有重要影響，短期暴露可能忽略了重要的生態(tài)毒理學(xué)現(xiàn)象，很可能過高或過低估計了重金屬的生態(tài)毒性。因此，有必要多從亞急性或慢性毒性角度來進一步研究重金屬對蛙蟾類毒性的影響。由于工業(yè)廢水多呈不連續(xù)排放，自然界中重金屬污染物的存在也可能是斷斷續(xù)續(xù)的，研究水中重金屬被 “清除”后，染毒動物的恢復(fù)情況亦極為重要。稻田環(huán)境中常有多種重金屬同時存在的情況，而多種重金屬共存時其聯(lián)合毒性機理非常復(fù)雜，不能簡單地由各單一重金屬毒性相加來判斷毒物的綜合毒性。

黑斑蛙皮膚是毒物進入蛙體的主要途徑。研究實驗中，除了胚胎及蝌蚪都直接浸于毒液中，多數(shù)學(xué)者將黑斑蛙成體也浸置于毒液中，讓毒物自然滲入動物體內(nèi)，無論在時間上還是劑量上，更接近毒物實際進入過程；也有學(xué)者采用將毒物注射入動物腹腔或皮下的方法，雖然劑量容易控制，但蛙體生理生化反應(yīng)可能偏激。

黑斑蛙重金屬致死劑量，絕大多數(shù)實驗者選擇的指標(biāo)是LC50（半致死劑量），但有些學(xué)者則采用分別觀測和統(tǒng)計LC10、LC50和LC90這樣更全面更準(zhǔn)確的指標(biāo)。

二、重金屬對黑斑蛙的毒害效應(yīng)

當(dāng)?shù)咎镏心撤N或某幾種重金屬達到或超過一定濃度時，即會不同程度地對黑斑蛙胚胎、蝌蚪及蛙體造成多方面的毒害。除了造成死亡率上升外，還表現(xiàn)在以下若干方面。

重金屬能增加卵膠膜的通透性，使胚胎能從外界獲得更多的氧氣而加快發(fā)育速度，進而縮短胚胎出膜時間。不同重金屬透過卵膠膜進入胚胎內(nèi)積累的量或?qū)ε咛サ亩拘源笮〔灰辉斐刹煌瑵舛扔绊懗瞿ぢ市Ч煌?/p>

重金屬會不同程度地抑制蝌蚪發(fā)育，這很可能是重金屬抑制甲狀腺激素通路造成的，也有可能是重金屬抑制紅細(xì)胞的生成，造成供氧不足，能量利用率降低，代謝損耗增加，從而導(dǎo)致蝌蚪生長延緩。另外，體內(nèi)積累大量重金屬后，可能使動物的攝食量減少，最終導(dǎo)致個體生長緩慢，變態(tài)延遲。

重金屬造成蝌蚪畸形主要表現(xiàn)為尾部異常彎折，這可能與尾部神經(jīng)最易遭受重金屬毒害有關(guān)。重金屬不僅對蛙心臟、眼、中樞神經(jīng)、骨骼產(chǎn)生致畸作用，精子生成、發(fā)育和活化受到抑制或精子出現(xiàn)畸形。

對染毒后蝌蚪、蛙蟾成體器官形態(tài)或組織顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)受損，精巢血管受損，心肌、脊髓和腦結(jié)構(gòu)受損。

由于尾部畸形，加上神經(jīng)系統(tǒng)受損，蝌蚪對外界刺激反應(yīng)的靈敏度及游泳運動能力下降。游泳能力的下降，進而導(dǎo)致蝌蚪反捕食能力降低。黑斑蛙受到低濃度重金屬影響后雖能完成變態(tài)，但登陸幼蛙體形偏小或體重較小。這不僅造成黑斑蛙生存率下降，性成熟率也降低，同時較小的體形會降低生殖適合度，進而影響種群動態(tài)。

三、重金屬對黑斑蛙的毒害影響

人類各種各樣的生產(chǎn)活動，如污水灌溉、重金屬制品以及化肥使用等造成的重金屬污染一直是引人關(guān)注的環(huán)境問題。重金屬離子具有很強的富集性，很難在環(huán)境中降解，且超過一定濃度后對黑斑蛙都有害，可以與蛋白質(zhì)及各種酶發(fā)生強烈的相互作用，使其失去活性，也可在某些器官中富集，造成黑斑蛙的急性中毒、亞急性中毒和慢性中毒等。

目前稻田研究較多的重金屬為鉛 （Pb2+）、鎘（Cd2+）、銅（Cu2+）、鋅（Zn2+）、硒（Se2+）、鋁（Al3+）、鉻（Cr3+）和汞（Hg2+）。在稻田實際種植環(huán)境中，污物中的重金屬主要也是這幾種。其中，研究最多，對黑斑蛙蝌蚪的毒性大小為 Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Cr3+＞Pb2+。

隨著廢水的排放，水域污染日益嚴(yán)重。其中鉛是最常見的重金屬之一，當(dāng)鉛離子濃度超過國家規(guī)定的農(nóng)田水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)時，就會對水生生物產(chǎn)生一定的毒害作用，進而對位于食物鏈上層的哺乳動物造成毒害。鉛是生物體許多酶的抑制劑，其毒性機理主要是抑制血紅素的合成，通過皮膚、消化道、呼吸道進入體內(nèi)與多種器官結(jié)合，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝并產(chǎn)生多系統(tǒng)性、多器官性的毒害作用。鉛對胚胎期的毒性于孵化期和開口期表現(xiàn)顯著，能影響黑斑蛙胚胎期和蝌蚪期的生存率，對蝌蚪的生長發(fā)育具有明顯的抑制作用。均導(dǎo)致蝌蚪頭部泡狀膨大、“S”型尾和形體較小。

汪美貞等（2012）以三種酶活性為指標(biāo)，進行了長期鉛暴露對雄性黑斑蛙生殖毒性的研究，隨著鉛染毒劑量的增加，Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性被誘導(dǎo)，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性被抑制，當(dāng)Ca2+-Mg2+-ATP酶的抑制程度超過前兩種酶的代償機制時，會抑制精子的發(fā)生，進而導(dǎo)致雄性生殖毒性；如細(xì)胞受損，精子總數(shù)受到影響，以及生精細(xì)胞受損，精子質(zhì)量受到影響。施蔡雷等（2010）報道黑斑蛙精巢MDA含量隨鉛、鎘暴露濃度的升高而明顯增加，且呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。說明低水平鉛、鎘的長期暴露對黑斑蛙精巢具有一定的損傷作用。GSH-Px活性對鉛、鎘暴露響應(yīng)最敏感，是指示鉛、鎘暴露的優(yōu)選生物標(biāo)志物。

賈秀英等（2009）報道隨鉛染毒劑量的升高，黑斑蛙精子數(shù)量下降，精子畸形率呈劑量依賴性增加，精子活動率呈劑量依賴性降低，血清中T水平明顯下降，E2水平則明顯升高，且均呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。鉛暴露對黑斑蛙精巢有明顯的毒性作用。低水平鉛的長期暴露可干擾生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，造成生殖功能紊亂，從而對精巢組織造成一定的損害作用。黑斑蛙肝臟 CAT對水環(huán)境中鎘和鉛等重金屬反應(yīng)靈敏，可以用其指示低劑量重金屬的早期污染。

重金屬鎘（Cd）是典型的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，對機體具有多器官和組織毒性。精巢是鎘作用的重要靶器官，對生殖功能具有較大的影響。鎘能促進活性氧自由基的產(chǎn)生，使機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。鎘是環(huán)境中普遍存在的、具有代表性的重金屬，是一種生物非必需的有毒元素，可在有機體內(nèi)與生物成分結(jié)合為金屬絡(luò)合物或金屬螯合物，從而導(dǎo)致酶失活或者使生物活性分子的生理功能受到抑制，從而影響酶的活性、鈣和磷的代謝、生長激素的分泌等，并具有明顯的致突變、致畸和致癌作用。

3.2.1 鎘對黑斑蛙精巢影響

研究者在光鏡下觀察精巢組織的顯微結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，鎘具有毒性效應(yīng)，可以導(dǎo)致處理后的黑斑蛙精巢組織中的各級生精細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞受到損傷。重金屬鎘對精巢發(fā)育、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑均有不良影響，被認(rèn)為是造成兩棲動物種群數(shù)量急劇下降的重要原因之一。曹慧等（2012）通過對鎘暴露后的黑斑蛙精巢活性氧自由基（ROS）、蛋白質(zhì)羰基（PCO）以及DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)等指標(biāo)的系統(tǒng)分析，研究指出鎘誘導(dǎo)機體產(chǎn)生ROS，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化損傷以及DNA損傷，說明精巢組織ROS的產(chǎn)生是鎘致雄性生殖毒害效應(yīng)機制的重要因素之一。

賈秀英等（2013）研究結(jié)果顯示，鎘可干擾兩棲動物精巢組織抗氧化和解毒的能力，從而導(dǎo)致明顯的生殖毒效應(yīng)，黑斑蛙精巢中乙氧基異酚惡唑脫乙基酶、紅霉素 N-脫甲基酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性的響應(yīng)可用來評價環(huán)境中低水平Cd的污染效應(yīng)。鎘可引起黑斑蛙精子數(shù)量減少和精子畸形率增加，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；亞急性鎘暴露對黑斑蛙精巢有明顯的毒性作用，其機制與鎘致黑斑蛙精巢組織標(biāo)志酶活力的降低和精巢脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。

3.2.2 鎘對黑斑蛙遺傳影響

賈秀英等（2011）采用慧星實驗檢測其精巢細(xì)胞 DNA損傷，報道指出ROS水平、MDA含量以及精巢細(xì)胞尾長和尾相與鎘暴露濃度之間均呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。研究者得出鎘引起兩棲動物黑斑蛙雄性生殖毒性的主要機制是誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷作用增強及DNA損傷。

3.2.2 鎘對黑斑蛙肝腎影響

賈秀英等（2006）研究了在不同濃度鎘(10～40 mg/L)中暴露30d黑斑蛙臟器組織的亞慢性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)鎘暴露濃度＞30mg/L時，黑斑蛙的肝臟指數(shù)顯著減少。黑斑蛙肝臟、腎臟和心臟Na+-K+-ATPase活性隨著Cd2+濃度的升高而降低，表現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。酶活性的變化在一定程度上反映了鎘對黑斑蛙的損傷作用。黑斑蛙在較低濃度鎘的30d長期暴露下，肝、腎組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高，導(dǎo)致機體發(fā)生氧化損傷。在鎘長期暴露下，細(xì)胞膜過氧化增強是鎘傷害機體的主要原因，而GSH含量、SOD活性的升高則可能是機體抗過氧化的機理之一。

徐敬明等（2005）研究表明鎘在黑斑蛙器官組織的積累具有選擇性，主要積累在腸和肝臟中，其次是皮膚、肌肉，而骨骼中沒有積累。動物體的肝臟作為重要的解毒器官，使其成為重金屬蓄積的重要靶器官，致使鎘在黑斑蛙的肝臟得以大量積累。兩棲類的皮膚濕潤裸露，滲透性強，進行皮膚呼吸，因此對鎘的積累作用明顯。

賈秀英等（2010）報道黑斑蛙肝臟中鎘的積累量、GSH（還原型谷胱甘肽）和MT（金屬硫蛋白）含量均隨著鎘暴露時間的延長而顯著升高，具有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。鎘可對黑斑蛙肝臟造成氧化損傷，而GSH、MT含量的升高則可能是機體抗氧化損傷的機理之一。研究者指出低濃度鎘的長期暴露可引起黑斑蛙肝蛋白質(zhì)氧化損傷和 DNA損傷，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基可能是導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA產(chǎn)生損傷的主要機制之一。鎘對兩棲動物具有蛋白質(zhì)氧化損傷作用和遺傳毒性作用，說明機體中過量的自由基堆積而引起組織蛋白質(zhì)氧化損傷，可能是鎘對黑斑蛙肝蛋白毒理作用的主要機制之一。

銅是生命必需的微量元素，作為氧化還原催化劑或氧的載體參與生物體內(nèi)多種酶的組成，但超過一定濃度就會產(chǎn)生毒性效應(yīng)，例如，水中的銅一旦被黑斑蛙蝌蚪的鰓截留，將隨血液迅速轉(zhuǎn)移到其他器官中，并主要積累在肝部，當(dāng)儲存超過一定量后，可以使血液中的血紅蛋白變性、乳酸脫氫酶等巰基酶活性受抑制，從而對機體產(chǎn)生毒性作用。張曼華（2009）報道銅離子使黑斑蛙蝌蚪紅細(xì)胞核異常率明顯提高，其平均紅細(xì)胞核異常率達到0.22%。銅離子一定的處理時間和質(zhì)量濃度下對蛙蝌蚪紅細(xì)胞有顯著的誘突變作用。

鉻是動物有機體必需的微量元素之一，對動物新陳代謝等生命活動具有較大的作用，參與動物體內(nèi)的糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，有降低血糖的作用，如果動物體內(nèi)鉻（Cr6+）含量過高，就會在細(xì)胞內(nèi)還原為Cr3+而構(gòu)成致癌物質(zhì)。

鉻是許多合金中的重要金屬，其化合物在工業(yè)生產(chǎn)中可通過多種途徑進入環(huán)境中，已成為環(huán)境污染中毒性最大的重金屬之一。生理pH下，鉻通常以鉻酸鹽的形式存在，被吸收后主要富集于腎臟、肝臟等，尤其是腎臟。Cr6+對環(huán)境生物具有較強的毒性，可嚴(yán)重影響動物中樞神經(jīng)、骨骼和眼的分化，引起睪丸萎縮和附睪精子減少、細(xì)胞 DNA損傷以及誘發(fā)肺癌的發(fā)生。王坤英等（2007）結(jié)合單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，使用12.5umol/L以上的重鉻酸鉀（K2Cr2O7）溶液對黑斑蛙外周血細(xì)胞具有明顯的DNA鏈斷裂損傷誘導(dǎo)效應(yīng)，重鉻酸鉀對黑斑蛙胚胎發(fā)育的影響不明顯，高濃度組重鉻酸鉀對黑斑蛙蝌蚪的生長發(fā)育則具有明顯的抑制作用。

汞在自然界主要以金屬汞、無機汞和有機汞化合物的形式存在，一般沉積在水體的底質(zhì)中，一旦進入身體后，Hg2+能與蛋白質(zhì)、酶類或谷胱甘肽中所含的-SH發(fā)生作用，形成牢固的硫醇基，從而使這些酶類的活性受到抑制，破壞細(xì)胞的基本功能和代謝，因此，對水生生物的危害和影響極為嚴(yán)重。汪學(xué)英等（2001）報道各重金屬離子對黑斑蛙胚胎的毒性順序為： Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Pb2+＞Cr6+，并對其原因進行了初步分析；各重金屬離子對蝌蚪期毒性大小依次為 Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Cr6+＞Pb2+。

鋅是污染重金屬之一。閆華超等（2007）不同質(zhì)量濃度的鋅離子對黑斑蛙蝌蚪的最終出膜率沒有顯著影響。鋅離子濃度越大，毒性效應(yīng)越強，致畸率越高。畸變類型主要表現(xiàn)為：尾部呈泡狀膨大、尾部呈“S”型、頭部呈泡狀膨大、個體形態(tài)較小。鋅處理組黑斑蛙蝌蚪相比對照組死亡率明顯增加，而且濃度越高死亡率越高。

硒具有重要營養(yǎng)功能，也是高毒性的非金屬元素，過量常會危害動物機體的生理機能，其中以無機硒（如硒化氫、亞硒酸鈉等）毒性較大。早期動物實驗已證明，過量的硒酸鹽和亞硒酸鹽能夠產(chǎn)生很強的生理毒性和遺傳毒性。祝文興等（2010）研究指出不同質(zhì)量濃度的硒酸鈉（1.25～20 mg/L）和亞硒酸鈉（0.25～4 mg/L）染毒處理7d后，黑斑蛙蝌蚪紅細(xì)胞的微核細(xì)胞率，隨染毒劑質(zhì)量濃度的升高呈先增大后減小的趨勢，核異常細(xì)胞率、總核異常細(xì)胞率均隨染毒劑質(zhì)量濃度的升高而增大。亞硒酸鈉的毒害作用明顯強于硒酸鈉，對黑斑蛙蝌蚪紅細(xì)胞均存在較強的細(xì)胞遺傳毒性。

四、總結(jié)

重金屬對黑斑蛙研究內(nèi)容多限于對LC50、畸形率等的測定或統(tǒng)計，以及對重金屬脅迫下抗氧化水平的影響；對實驗結(jié)果的分析多是描述性的，而從深層次的等位酶角度、基因角度開展實驗和分析重金屬毒害的研究很少，對體內(nèi)一些重要物質(zhì)（如 MT）的代謝及重金屬在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運、積累及排出機制等研究較少，黑斑蛙對重金屬敏感性不同的機理和不同重金屬相互之間的 “協(xié)同”或“拮抗”機理的研究有待加強。

參考文獻（略）