不同運(yùn)動強(qiáng)度上調(diào)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)誘導(dǎo)心臟細(xì)胞增殖

周云鶴，費(fèi) 儉，楊 樺，秦黎黎，孫靜瑜，李 青

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不同運(yùn)動強(qiáng)度上調(diào)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)誘導(dǎo)心臟細(xì)胞增殖

周云鶴1，費(fèi) 儉1，楊 樺1，秦黎黎1，孫靜瑜1，李 青2

1. 同濟(jì)大學(xué), 上海 200092; 2. 復(fù)旦大學(xué) 腦科學(xué)研究院, 上海 200433

目的：探討不同運(yùn)動強(qiáng)度對成體小鼠心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Isl1基因表達(dá)的影響及誘導(dǎo)心臟細(xì)胞增殖的作用。方法：雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為安靜對照組（C）、有氧運(yùn)動組（A）和過度運(yùn)動組（E），每組6只。A組和E組分別采用小動物跑臺方式進(jìn)行為期4周不同強(qiáng)度的訓(xùn)練。訓(xùn)練結(jié)束后采用超聲心動圖方法對心臟各層結(jié)構(gòu)界面和心功能做定性定量觀察與分析，Real-Time PCR法檢測心肌Isl1基因和增殖因子PCNA表達(dá)，血常規(guī)和血清生化檢測分析CK和CK-MB等心肌酶譜表達(dá)，HE染色觀察分析心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果：運(yùn)動誘導(dǎo)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物基因Isl1表達(dá)上調(diào)，且促進(jìn)細(xì)胞增殖因子PCNA的表達(dá)上調(diào)；有氧運(yùn)動比過度運(yùn)動的效果更顯著；超聲心動圖結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動可以顯著改善心功能，提高心系數(shù)。結(jié)論：運(yùn)動可有效提高小鼠心臟內(nèi)源性心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Isl1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖因子PCNA表達(dá)增加，改善心臟功能。其中，有氧運(yùn)動比過度運(yùn)動對心臟形態(tài)和功能改善更顯著。探索不同運(yùn)動強(qiáng)度對心臟細(xì)胞再生的影響，將有助于驗(yàn)證或補(bǔ)充成體心肌祖細(xì)胞自我更新和分化的生物學(xué)機(jī)制，為運(yùn)動醫(yī)學(xué)、運(yùn)動康復(fù)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)提供有價(jià)值的實(shí)踐依據(jù)。

心肌祖細(xì)胞；Isl1；超聲心動圖；運(yùn)動強(qiáng)度；細(xì)胞增殖

成體心肌組織的更新和分化研究成為近年來關(guān)注的熱點(diǎn)[14]。心肌細(xì)胞增殖可作為心臟損傷后修復(fù)再生的基礎(chǔ)，對于治療心肌損傷后心肌細(xì)胞損失及再生不足等導(dǎo)致的心功能不全、心律失常和心臟衰竭等嚴(yán)重心臟疾病具有重要意義。

心臟干/祖細(xì)胞（cardiac stem cells, CSCs/cardiac progenitor cells, CPCs）療法是心肌損傷修復(fù)的重點(diǎn)治療策略。其中，非創(chuàng)傷性的促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞再生[11,17]不僅可以提供一種非侵入性的治療，而且能夠規(guī)避移植引起的免疫抑制，正越來越受到重視。促進(jìn)成體心臟心肌干/祖細(xì)胞的更新和分化，以及有效動員足量的干/祖細(xì)胞歸巢，修復(fù)受損心肌組織，是目前生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和康復(fù)醫(yī)學(xué)共同關(guān)注的重要課題。CPCs標(biāo)記物是心肌祖細(xì)胞分類的標(biāo)志，能夠作為祖細(xì)胞因子受體，通過改變微環(huán)境對細(xì)胞遷移、定植和分化等起到調(diào)節(jié)作用。至今研究者已發(fā)現(xiàn)多種類型不同標(biāo)記的心肌祖細(xì)胞，主要包括C-kit、Sca-1、Nkx 2.5、Flk1、GATA4 和Isll等[9,10,12,20]。這些心肌祖細(xì)胞具有不同的表型特征和分化潛能，但是各類型心肌祖細(xì)胞的分化潛能尚未得到充分證實(shí)。

在眾多心肌干/祖細(xì)胞的熱點(diǎn)標(biāo)志物研究中，IsI1已被證明是胚胎心臟組織干細(xì)胞的標(biāo)志物[18]，Isl1陽性細(xì)胞是胚胎心臟發(fā)育中重要的原始祖細(xì)胞，利用譜系追蹤技術(shù)對Isl1陽性細(xì)胞分化研究顯示，其能夠分化為血管內(nèi)皮、心內(nèi)膜、平滑肌、右室及左房肌等全部心臟細(xì)胞譜系[19,25]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動誘導(dǎo)的心肌肥大是一個(gè)平衡的和可逆的生理性增長過程[6]，許多因子參與了細(xì)胞增殖的調(diào)控，Isl1參與心肌肥大與增殖調(diào)節(jié)。此外，Isl1陽性細(xì)胞在胚胎發(fā)育期、出生后直到成年都存在[15]，是目前心臟中發(fā)現(xiàn)的唯一一類能用單一標(biāo)記進(jìn)行識別的祖細(xì)胞，因此，Isl1陽性細(xì)胞是用于研究心臟再生的最佳潛在性內(nèi)源祖細(xì)胞。綜上所述，Isl1陽性細(xì)胞具有成為運(yùn)動誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的內(nèi)源性心肌祖細(xì)胞來源的可能性。但是運(yùn)動能否誘導(dǎo)Isl1陽性細(xì)胞自我更新與分化目前未見報(bào)道。

本研究選擇心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物基因Isl1作為主要研究對象，選用野生型雄性C57BL/6J小鼠，采用小動物跑臺的運(yùn)動方式，不同的運(yùn)動負(fù)荷干預(yù)，通過超聲心動圖、體重、心系數(shù)、血液生化檢測、細(xì)胞增殖因子和轉(zhuǎn)錄因子檢測以及HE染色等多種方式，研究不同運(yùn)動強(qiáng)度對小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，探索有氧運(yùn)動和超負(fù)荷運(yùn)動對成年小鼠心臟心肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，研究結(jié)果將有助于驗(yàn)證或補(bǔ)充成體心肌祖細(xì)胞自我更新和分化的影響及生物學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象及分組

雄性野生型C57BL/6J小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供。運(yùn)動模型建立及動物飼養(yǎng)在同濟(jì)大學(xué)動物房?；\內(nèi)鋪蓋滅菌的木屑墊料，每隔12 h光暗循環(huán)，每日小鼠自由進(jìn)食，標(biāo)準(zhǔn)鼠糧及飲水均經(jīng)過輻照殺毒或高溫高壓滅菌處理。動物福利及實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。動物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方案獲得上海南方模式生物研究中心實(shí)驗(yàn)動物看護(hù)及使用倫理委員會的批準(zhǔn)（SRCMO-IACUC NO. 20140002）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

主要儀器：運(yùn)動干預(yù)采用JD-PT小動物實(shí)驗(yàn)跑臺，超聲心動圖數(shù)據(jù)使用Visual Sonics770型小動物超聲儀采集，組織切片采用Thermo Shandon全自動組織石蠟包埋機(jī)進(jìn)行切片，用90iNikon光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，采用MP Biomedicals Fast Prep-24勻漿系統(tǒng)、Beckman Coulter（Microfuge 22R）冷凍離心機(jī)和CFX96 Real-Time System PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)測試，使用Sysmex CHEMIX-180全自動生化分析儀進(jìn)行血生化測試等。

主要試劑：異氟醚、多聚甲醛和戊巴比妥鈉購于Sigma公司，蘇木素/伊紅染液購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司，6×Loading Buffer（核酸專用）和限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa有限公司，PCR試劑盒購自天根公司，Trizol購自Roche公司；DEPC水購自上海生工，瓊脂糖Regular Agarose G-10購自BioWest，蛋白酶K購自Merck Millipore 公司，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution, PBS）購于碧云天生物技術(shù)研究所等。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與運(yùn)動方案

實(shí)驗(yàn)干預(yù)為28天，運(yùn)動強(qiáng)度參照Bedford訓(xùn)練模型標(biāo)準(zhǔn)[8]并進(jìn)行適當(dāng)修改。將雄性野生型C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成3組：安靜對照組（C）、有氧運(yùn)動組（A）和過度運(yùn)動組（E），每組6只。C組正常飲食，不干預(yù)，籠內(nèi)自由活動。A組和E組在電動鼠類跑臺上進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1周，每周5次，每次訓(xùn)練20 min，速度為10 m/min，旨在使其熟悉跑臺運(yùn)動方式。

正式跑臺訓(xùn)練4周。有氧運(yùn)動組：速度15 m/min，坡度0°，60 min/天，每日下午4∶00-5∶00進(jìn)行訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6天，間隔1天，周日休息。超負(fù)荷運(yùn)動組：速度25～35 m/min，逐漸遞增，坡度10°～15°逐漸遞增，時(shí)間90 min/天至120 min/天，逐漸遞增。每日下午4∶00-6∶00進(jìn)行訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6天，間隔1天，周日休息。

超負(fù)荷運(yùn)動標(biāo)準(zhǔn)：動物不能堅(jiān)持本級負(fù)荷跑速，先后滯于跑道后1/3處達(dá)6次以上，聲光電力刺激驅(qū)趕無效。

1.4 測試指標(biāo)與方法

1.4.1 超聲心動圖檢測

超聲心動圖是應(yīng)用超聲波回聲探查心臟和大血管以獲取有關(guān)信息，將心臟各層結(jié)構(gòu)界面活動情況的空間和時(shí)間變化以影像或曲線形式記錄下來的一組無創(chuàng)性檢查方法。超聲心動圖可對心臟解剖和心功能做出定性診斷和定量分析。本研究超聲心動圖檢測評價(jià)運(yùn)動小鼠左心室功能具體步驟如下：

1. 運(yùn)動訓(xùn)練結(jié)束后24 h，小鼠異氟醚吸入麻醉。

2. 小鼠麻醉穩(wěn)定后固定，心前區(qū)脫毛，取仰臥位。

3. 超聲心動圖檢測使用Visual Sonics Vevo 770高分辨率小動物超聲系統(tǒng)，可對小鼠多臟器的兩維超聲圖像采集，心臟M型超聲檢測，解剖型心動周期重建，心功能分析檢測等。配有氣體麻醉系統(tǒng)，使小鼠的麻醉趨于持續(xù)性，小鼠的心率保持穩(wěn)定性，在進(jìn)行超聲過程中使其處于正常的生理狀態(tài)；數(shù)字射頻輸出模塊，能記錄心肌運(yùn)動、血管張力等變化。寬頻探頭（RMVTM707B），頻率30 MHz，聚焦深度1.3 cm，在小鼠胸骨左緣、胸骨右緣、心尖部及胸骨上窩掃查。

采集小鼠心臟的二維、M型超聲心動圖像和脈沖多普勒檢測血流頻譜，并進(jìn)行心臟結(jié)構(gòu)、各瓣口血流及時(shí)間參數(shù)的測量，測量評價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和功能的各項(xiàng)參數(shù)。

3組小鼠，每組6只，每只小鼠在每個(gè)切面上檢測2次，每次讀取連續(xù)5個(gè)心動周期數(shù)值，取平均值用于統(tǒng)計(jì)。

4. 記錄左室收縮期末徑（Left Ventricular Internal Diameter at end systole，LVIDs）、左室舒張期末徑（Left Ventricular Internal Diameter at end diastole，LVIDd），室間隔收縮末期厚度（Interventricular Septal Thickness at systole，IVSs），室間隔舒張末期厚度（Interventricular Septal Thickness at diastole，IVSd），收縮末左室后壁厚度（Left Ventricular Posterior Wall at systole，LVPWs），舒張末左室后壁厚度（Left Ventricular Posterior Wall at diastole，LVPWd）。

由超聲心動圖程序自動計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（Left Ventricular Ejection Fraction, LVEF）、左室短軸縮短率（Left Ventricular Fractional Shortening，LVFS）。

5. 超聲醫(yī)師操作前未知悉小鼠分組情況，在操作時(shí)盡量避免對小鼠胸廓施壓，以免影響心率和測量數(shù)據(jù)。

1.4.2 血清生化檢測

本實(shí)驗(yàn)血清生化檢測指標(biāo)主要選取心肌酶譜：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同功酶（CK-MB）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）等指標(biāo)變化進(jìn)行小鼠運(yùn)動機(jī)能的評定。本實(shí)驗(yàn)血清檢測樣本取材：1.5 ml EP管收集小鼠全血，收集后立刻放入4℃冰箱中。所有樣本取好后離心，3 000 rpm×10 min，取上清，用于生化指標(biāo)檢測。

1.4.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測增殖因子和心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)

提取3組小鼠心臟組織總RNA、反轉(zhuǎn)cDNA、Real time PCR法檢測細(xì)胞增殖因子和轉(zhuǎn)錄因子在心臟組織的表達(dá)情況。每組取3只小鼠的心臟組織RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。

表1 Real time PCR法檢測的引物序列表

擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120 V，20 min）。

1.4.4 HE染色組織檢測

心臟組織樣本（3組小鼠，每組3只）4%PFA固定24 h后，轉(zhuǎn)移至組織夾中，流水沖洗5～10 min，以去除殘余的多聚甲醛。使用Thermo Shando全自動組織處理機(jī)完成組織塊的脫水、浸蠟等過程。步驟：1）脫蠟：切片經(jīng)60℃烘干30 min后，二甲苯脫蠟2次，每次浸泡15 min；2）水化：梯度乙醇處理，依次經(jīng)100%、100%、95%、75%、50%乙醇、去離子水浸泡，每步5 min；3）蘇木素染色：蘇木素染液浸泡2 min，流水沖洗至切片顏色穩(wěn)定；4）分色（可選）：如蘇木素染色過深，可用1%鹽酸酒精進(jìn)行分色，時(shí)間1～2 s，完成后用流水沖洗，直至核返藍(lán)；5）伊紅染色：伊紅染液浸泡2 min，自來水沖洗5 min至切片顏色穩(wěn)定；6）脫色：如伊紅染色過深，可用95%乙醇適度浸泡脫色，時(shí)間1～2 s；7）脫水：梯度乙醇處理，依次經(jīng)50%、75%、95%、100%、100%乙醇浸泡，每步5 min；8）透明：二甲苯浸泡2次，每次10 min；9）封片：切片自二甲苯取出，待稍微晾干后用中性樹膠封片，并于通風(fēng)櫥中吹干2～3 h。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±）表示。數(shù)據(jù)組間比較采用方差分析（one way or two-way ANOVA，Bonferroni post hoc analysis）和Studengt’s t-test方法。當(dāng)＜0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及繪制圖表使用軟件Graph Pad Prism 5.0完成。

2 研究結(jié)果

2.1 不同運(yùn)動強(qiáng)度對小鼠心功能的影響

采集小鼠心臟的二維、M型超聲心動圖像和脈沖多普勒檢測血流頻譜，測量評價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和功能的各項(xiàng)參數(shù)。3組小鼠的超聲心動圖片如圖1所示：E組小鼠的M型超聲心動圖顯示二尖瓣前葉活動曲線CD段出現(xiàn)一個(gè)向上突起的異常波形（即SAM征），致使左室流出道內(nèi)徑變窄，室間隔肥厚，左室內(nèi)徑減小。

圖1 小鼠不同強(qiáng)度運(yùn)動4周的超聲心動圖

Figure 1. Echocardiography of Mice at Different Exercise Intensity for 4 Weeks

射血分?jǐn)?shù)（EF）的值（圖2A），A組明顯升高，與C組相比有顯著性差異（=0.002），E組與C組相比沒有顯著性差異。

左室短軸縮短率（FS）結(jié)果（圖2B）：A組明顯升高，與C組相比有顯著性差異（=0.002），E組與C組相比沒有顯著性差異。

收縮末左室后壁厚度（LVPWs）結(jié)果：A組明顯升高（圖2C），與C組相比有非常顯著性差異（＜0.001），E組與C組相比有顯著性差異（=0.026）。

室間隔收縮末厚度（IVSS）結(jié)果：A組明顯升高（圖2D），與C組相比有顯著性差異（=0.034），E組與C組相比沒有顯著性差異。

左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）結(jié)果：A組明顯降低（圖2E），與C組相比有顯著性差異（=0.002），E組與C組相比沒有顯著性差異。

左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）結(jié)果（圖2F）：A組明顯降低，與C組相比有顯著性差異（=0.002），E組與C組相比沒有顯著性差異。

注：A：射血分?jǐn)?shù)（EF），B：左室短軸縮短率（FS），C：收縮末左室后壁厚度（LVPWs），D：室間隔收縮末厚度（IVSS），E：左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs），F(xiàn)左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，圖3、圖4同。

Figure 2. Hyperdata Results of Mice at Different Exercise Intensity for 4 Weeks

2.2 心系數(shù)結(jié)果

心系數(shù)為心臟重量與體重的比值，是反映心肌肥大的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為，運(yùn)動性肥大是心臟對運(yùn)動訓(xùn)練的適應(yīng)性反應(yīng)，是一種生理性心臟重塑的過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4周有氧運(yùn)動后小鼠心臟重量及心系數(shù)增加，與C組相比具有顯著性差異（表2），表明有氧運(yùn)動誘導(dǎo)了心臟肥大的形成。而E組小鼠心臟重量及心系數(shù)變化不大，與C組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異。

表2 運(yùn)動4周后小鼠體重、心臟重量及心系數(shù)變化

注：***表示＜0.001。

2.3 心肌酶譜指標(biāo)結(jié)果

運(yùn)動4周后，小鼠心肌酶譜指標(biāo)檢測結(jié)果（圖3）：肌酸激酶（CK）結(jié)果，A組明顯降低，與C組相比有顯著性差異（=0.014），E組顯著升高，與C組相比有顯著性差異（=0.035）。肌酸激酶同功酶（CK-MB）結(jié)果，A組明顯降低，與C組相比有顯著性差異（=0.005），E組顯著升高，與C組相比有顯著性差異（=0.017）。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）結(jié)果，A組明顯降低，與C組相比有顯著性差異（=0.016），E組與C組相比沒有顯著性差異。

圖3 不同強(qiáng)度運(yùn)動4周小鼠的心肌酶譜結(jié)果

Figure 3. CK , CK-MB and AST Results of Mice at Different Exercise Intensity for 4 Weeks

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測增殖因子和心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物結(jié)果

Real-time PCR 法檢測增殖因子PCNA和心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Isl1在心臟組織表達(dá)情況，增殖因子PCNA結(jié)果（圖4A）：A組明顯升高，與C組相比有顯著性差異（＜0.0001），E組與A組相比升高，有顯著性差異（=0.003）；心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Isl1結(jié)果如圖4B所示，Isl1在A組和E組都有增加，其中，A組與C組相比有顯著性差異（=0.004），E組與C組相比有顯著性差異（=0.035）。

圖4 增殖因子和心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果

Figure 4. Expression of Growth Factor and Myocardial Progenitor Cell Markers

2.5 HE組織染色結(jié)果

心肌組織HE染色觀察：HE染色顯示，C組小鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，著色均勻，細(xì)胞核大小均勻，位于心肌纖維的中央，未見肌絲斷裂（圖5 Control）；E組小鼠心肌纖維數(shù)量減少，心肌橫截面空白區(qū)域明顯多于C組，可見肌纖維斷裂，但未見變性及壞死改變（圖5 Excessive）；A組小鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，可見肌細(xì)胞增粗，細(xì)胞境界清楚，心肌橫截面空白區(qū)域少于超負(fù)荷運(yùn)動組，肌絲斷裂較少見（圖5 Aerobic），但細(xì)胞未見變性和壞死等改變。

圖5 小鼠不同強(qiáng)度運(yùn)動4周的心臟HE染色結(jié)果（X40）

Figure 5. Cardiac HE Staining rResults of Mice at Different Exercise Intensity for 4 Weeks（X40）

3 分析與討論

LIM同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1（insulin transcription factor1, Isl1）基因也被稱為胰島素增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1（islet-1，Isl1），屬于LIM同源框基因家族，是1990年瑞典的Karlsson等[16]在研究胰島素基因表達(dá)調(diào)控過程中，從大鼠胰島素瘤細(xì)胞系RIN的cDNA文庫中首次發(fā)現(xiàn)，并被克隆測序。Isl1是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，可以作用于不同的下游靶基因，在許多組織和器官的發(fā)育進(jìn)化過程中，如心臟和胰腺的器官形成、運(yùn)動神經(jīng)元的分化等[18,21,26]，發(fā)揮重要的作用，包括影響細(xì)胞的增殖、分化和遷移等。

Isl1最近幾年被發(fā)現(xiàn)在心臟發(fā)育過程中起重要作用。研究表明，Isl1基因敲除小鼠心血管發(fā)育不全，在E9.5心臟發(fā)育停滯，并在E10.5死亡[12,28]。Isl1在特異的心肌前體細(xì)胞中表達(dá)，并隨著心臟的發(fā)育表達(dá)量逐漸下降。Isl1在早期發(fā)育過程中的正常表達(dá)，對心肌前體細(xì)胞的增殖、遷移和存活是必需的[25]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，Isl1可以協(xié)同多個(gè)基因共同調(diào)控心臟發(fā)育，進(jìn)而影響整個(gè)心臟發(fā)育的過程，如Isl1與Gata4及Nkx2.5能夠共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[7,13,29-31]。Isl1和有關(guān)基因在心臟發(fā)育過程中表達(dá)異常會導(dǎo)致各種先天性心臟病的出現(xiàn)[2,24,34]。

Isl1陽性細(xì)胞被認(rèn)為是內(nèi)源性心肌祖細(xì)胞，可以分化生成心臟發(fā)育所需約2/3的細(xì)胞，即可以分化成心肌細(xì)胞系、內(nèi)皮細(xì)胞系和平滑肌細(xì)胞系[18]，以及所有心血管隔室和傳導(dǎo)系統(tǒng)的主要細(xì)胞類型[23]。本研究表明，適宜規(guī)律的運(yùn)動能夠降低實(shí)驗(yàn)動物體重，增加心臟重量，增大心肌細(xì)胞直徑和細(xì)胞體積等形態(tài)學(xué)指標(biāo)，提高心系數(shù)和左室短軸縮短率等心功能指標(biāo)，與以往研究報(bào)道的運(yùn)動模型相符[1,3,22]。本研究選用的C57小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的生長發(fā)育變化主要發(fā)生在4周齡以前，4周齡以后心臟的生長發(fā)育趨于成熟。因此可以表明，適宜的規(guī)律性運(yùn)動有助于成年小鼠心臟功能的提高和心系數(shù)的增加，引起運(yùn)動型心臟肥大。

心肌生理性肥大和病理性肥大的早期形態(tài)學(xué)非常相似，都表現(xiàn)為室壁增厚和質(zhì)量增加，解剖學(xué)水平上很難區(qū)分。細(xì)胞水平上，都表現(xiàn)出心肌細(xì)胞體積增大、直徑增寬和肌節(jié)增加。病理性心肌細(xì)胞肥大是心臟對抗血流動力學(xué)增加、肌損傷和神經(jīng)激素應(yīng)激等的共同反應(yīng)。受損的心臟，肥厚機(jī)制被激活，心肌細(xì)胞生長，成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，相應(yīng)的心室壁增厚，左室重量增加，心肌纖維化及心臟舒張功能降低[32,33]。從長遠(yuǎn)來看，可導(dǎo)致嚴(yán)重的收縮和舒張功能障礙，導(dǎo)致失代償性充血性或纖維化心臟衰竭。

截止目前，關(guān)于運(yùn)動性心肌肥大機(jī)制的研究，主要集中于心肌實(shí)質(zhì)成分與間質(zhì)成分的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)與分子生物學(xué)等方面，對心肌細(xì)胞的發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究報(bào)道尚少[27]。關(guān)于運(yùn)動促進(jìn)心肌干細(xì)胞的動員、增殖和分化的報(bào)道少見。

本研究結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動組和超負(fù)荷運(yùn)動組野生型小鼠心臟增殖因子PCNA都增加，具有顯著性差異（＜0.000 1和=0.003），表明不同運(yùn)動強(qiáng)度對心肌細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，引起的心肌肥大伴隨著增殖的發(fā)生。

心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Isl1的表達(dá)，與對照組相比，有氧運(yùn)動組和超負(fù)荷運(yùn)動組野生型小鼠心臟Isl1表達(dá)量都升高，具有顯著性差異（=0.004和=0.035），表明不同運(yùn)動強(qiáng)度促進(jìn)了小鼠心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的提高。

本研究結(jié)果顯示，運(yùn)動能夠促進(jìn)野生型小鼠心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Isl1的提高，增強(qiáng)細(xì)胞增殖因子PCNA的表達(dá)，但是運(yùn)動是否促進(jìn)了Isl1+細(xì)胞的增殖，或者運(yùn)動促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞來源是否為Isl1+細(xì)胞？目前尚不能明確，后續(xù)需要進(jìn)行譜系示蹤研究來確定適宜的運(yùn)動促進(jìn)心臟細(xì)胞增殖的來源。

本研究體現(xiàn)了發(fā)育生物學(xué)、心臟醫(yī)學(xué)和運(yùn)動人體科學(xué)等多學(xué)科交叉融合的科學(xué)發(fā)展思想，研究結(jié)果將有助于驗(yàn)證或補(bǔ)充成體心肌祖細(xì)胞自我更新和分化的影響及機(jī)制。

4 結(jié)論

運(yùn)動誘導(dǎo)成體野生型小鼠心臟Isl1基因表達(dá)上調(diào)，且促進(jìn)心臟細(xì)胞增殖因子PCNA的表達(dá)上調(diào)，有氧運(yùn)動比超負(fù)荷運(yùn)動的效果更顯著。超聲心動圖結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動可以顯著改善心功能，提高心系數(shù)。

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Different Exercise Intensity Up-regulate Marker of Cardiac Progenitor Cells and Induce Cell Proliferation in Adult Heart

ZHOU Yun-he1, FEI Jian1, YANG Hua1, QIN Li-li1, SUN Jing-yu1, Li Qing2

1. Tongji University, Shanghai 200092, China; 2. Fudan University, Shanghai 200433, China.

Objectives: The aim of this study is to dissect the function of marker of cardiac progenitor cells (Isl1) in cardiac cell proliferation in adult mammals under different exercise Intensity.Methods:2-month old adult male C57BL/6J mice were randomly divided into 3 groups(n=6): control(C), aerobic training(A) and excessive exercise (E).Mice in A and E were underwent 4-week’s training program using small animal treadmill with gradually increasing intensity.Heart function was evaluated by small animal echocardiography. Marker of Cardiac Progenitor Cells (Isl1) and Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were observed and analyzed by Real Time PCR. Myocardium was observed hematoxylin-eosin staining. Myocardial enzymes were measured by blood biochemical tests.Results: Exercise resulted in the up-regulation of gene expression both for Marker of Cardiac Progenitor Cells (Isl1) and cell proliferation factor (PCNA). Different exercise intensity could increase the expression of cardiac progenitor cell marker. The effect of aerobic training was more significant than overload exercise. The results of echocardiography show that aerobic exercise can significantly improve cardiac function and heart coefficient. Conclusions: Exercise can effectively stimulate the mouse heart, increase the expression of endogenous marker of cardiac progenitor cells(Isl1), promote the expression of Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), and improve heart function. The effect of aerobic training was more significant than excessive exercise for the heart shape and function improvement. Exploring the effects of different exercise intensity on cardiac cell regeneration will help to validate or supplement the influences and mechanisms of cell proliferation and differentiation of adult cardiac progenitor cells, and provide valuable practical basis for sports medicine, sports rehabilitation and preventive medicine.

G804.5

A

1000-677X(2018)06-0053-07

10.16469/j.css.201806006

2018-01-08；

2018-06-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401019)。

周云鶴,女,博士,講師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動與干細(xì)胞,E-mail:maggie211@#edu.cn; 費(fèi)儉,男,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)榻M織干細(xì)胞與模式生物,E-mail:Jfei@#edu.cn。