檢測(cè)高效氯氟氰菊酯殘留試劑盒的研制

◎ 羅維超，扶 勝，鄧小霞，袁學(xué)偉

（貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司，貴州 貴陽 550009）

高效氯氟氰菊酯又叫三氟氯氰菊酯、功夫菊酯等，是一種廣譜菊酯類殺蟲劑，用于花生、大豆、果樹、蔬菜的害蟲防治，具有殺蟲譜廣、活性高、藥效迅速、噴灑后耐沖刷等特點(diǎn)。噴灑于蔬菜水果上的農(nóng)藥有一部分會(huì)殘留，甚至被吸收，人類食用這些蔬菜水果就會(huì)使農(nóng)藥中的高效氯氟氰菊酯進(jìn)入人體，對(duì)人體產(chǎn)生危害。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，高效氯氟氰菊酯在蘋果、李、柑橘等水果以及蔬菜中的最大殘留量為0.2 mg/kg[1-2]。為了了解高效氯氟氰菊酯在日常攝入的蔬菜、水果等食物中的殘留情況，以保障人民的身體健康以及實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)大批量短時(shí)間的高效氯氟氰菊酯在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留檢測(cè)，本文報(bào)道了一種檢測(cè)方法同時(shí)研發(fā)出相應(yīng)的產(chǎn)品，為相關(guān)部門進(jìn)行有關(guān)農(nóng)產(chǎn)品的快速檢測(cè)工作提供一種可靠的方法。

目前，高效氯氟氰菊酯殘留分析一般使用氣相色譜法（GC）[3]，還有一些關(guān)于高效液相色譜法（HPLC）[4]和色譜質(zhì)譜聯(lián)用，這些方法靈敏度較高、測(cè)定較為準(zhǔn)確，而且可以同時(shí)檢測(cè)多種藥物，但其檢測(cè)成本較高，而且對(duì)操作人員有較高的要求，因此限制了此種檢測(cè)方法在樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、批量、快速檢測(cè)的使用，從而阻礙了其推廣大范圍的使用。相比于儀器檢測(cè)的方法，酶聯(lián)免疫法操作簡(jiǎn)便、用時(shí)較短，檢測(cè)成本低、操作人員只需稍微培訓(xùn)即可上手操作，可實(shí)現(xiàn)批量樣品的快速篩選檢測(cè)，以及技術(shù)的推廣使用。目前，在酶聯(lián)免疫分析領(lǐng)域具有相關(guān)的報(bào)道，只有王鳴華等進(jìn)行了人工抗原的合成。目前，尚未有該方法在水果、谷物對(duì)于高效氯氟氰菊酯殘留檢測(cè)中應(yīng)用的報(bào)道以及相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品的生產(chǎn)。本文旨在建立一種用酶聯(lián)免疫吸附分析方法快速、靈敏地檢測(cè)水果、蔬菜、谷物中高效氯氟氰菊酯，為我國農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控提供理論依據(jù)和一種可靠地途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠（6～8周齡），貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司；高效氯氟氰菊酯（純度≥99%），常熟恒榮商貿(mào)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

勻漿機(jī)（常州市萬合儀器制造有限公司），電子天平（上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司），KS-Ⅱ振蕩器（上海圣科儀器設(shè)備有限公司），QL-901漩渦混合器（常州億能實(shí)驗(yàn)儀器廠），低速離心機(jī)、氮吹儀（貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司），微量移液器（單道20 ～ 200 μL、100～ 1 000 μL，多道 20 ～ 300 μL，浙江力辰儀器科技有限公司），生化培養(yǎng)箱（上海平軒科學(xué)儀器有限公司），酶標(biāo)儀（北京線上生物科技有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、低溫冷卻水循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），三用紫外分析儀（成都啟運(yùn)通儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 高效氯氟氰菊酯半抗原的合成

（1）高效氯氟氰菊酯原藥的氧化。高效氯氟氰菊酯雙鍵氧化反應(yīng)如圖1所示。在三口瓶中，將高效氯氟氰菊酯溶于乙腈，并冷卻到0 ℃，開始分批加入高錳酸鉀，每批間隔3 min，加畢，保持溫度攪拌反應(yīng)，當(dāng)高錳酸鉀的紫色剛好褪去時(shí)，快速過濾，用10 mL丙酮洗滌濾餅，合并洗滌液和濾液，進(jìn)行減壓蒸餾，得黃色油狀液體，將該油狀液體進(jìn)行硅膠柱層析，干法裝柱，收集Rf值最小的那個(gè)點(diǎn)的組分，得到淡黃色油狀液體，即為目標(biāo)產(chǎn)物。

圖1 高效氯氟氰菊酯雙鍵氧化反應(yīng)圖

（2）半抗原的制備。將第一步的產(chǎn)品溶于重蒸處理過的二氯亞砜中，加入1滴DMF，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)過夜，次日，將反應(yīng)液進(jìn)行減壓蒸餾，蒸干后向剩余物中加入10 mL正己烷，蒸干，再加入，再蒸干，如此循環(huán)3次后得黃色油狀液體。將此油狀液體快速稱重確定質(zhì)量，然后立即溶于干燥的四氫呋喃中，-20 ℃保存?zhèn)溆?，?-氨基丁酸溶于氫氧化鈉水溶液中，氫氧化鈉為1當(dāng)量，冰浴冷卻到0 ℃，然后緩慢滴加冷藏于-20 ℃中酰氯的四氫呋喃溶液，滴畢，保持溫度繼續(xù)反應(yīng)30 min，然后撤去冰浴恢復(fù)室溫反應(yīng)2 h，TLC法確定反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)，反應(yīng)液分層，吸出上層溶液，將下層溶液用乙酸乙酯提取3次，每次用量10 mL，合并提取液和上層溶液，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾，得黃色油狀液體，將產(chǎn)品用硅膠柱層析提純，收集Rf值最低的紫外點(diǎn)所示組分，得淡黃色油狀液體即為目標(biāo)化合物。

圖2 氧化產(chǎn)物羧基制備酰氯接4-氨基丁酸圖

1.3.2 人工抗原的制備

免疫原的制備：稱取40 mg半抗原溶于1 mL DMF，加入60 mg EDC和40 mg NHS，室溫反應(yīng)1 h；反應(yīng)液澄清后，將其緩慢滴加到濃度為30 mg/mL BSA的PBS（pH7.2）中，滴畢，保持室溫?cái)嚢柽^夜；用0.01 mol/L PBS透析3d，每天換2次透析液，透析完成后，以8 000 r/min離心30 min，取上清液，即為相應(yīng)的免疫抗原，分裝，于-20 ℃條件下凍存?zhèn)溆?。包被抗原的制備只將牛血清白蛋白BSA更換為卵清蛋白OVA進(jìn)行和上述方法相同操作即得。

1.3.3 單克隆抗體的制備

用常規(guī)的方法制備抗體，用飽和硫酸銨來純化抗體。

1.3.4 抗原抗體最適工作濃度的選擇

分別將包被抗原和單克隆抗體溶液進(jìn)行稀釋，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方陣實(shí)驗(yàn)，選取OD450最接近于1的抗體濃度作為抗體的最適工作濃度。

1.3.5 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法的建立

（1）酶標(biāo)板的包被。用相應(yīng)的緩沖液將包被原稀釋成最佳工作濃度后，點(diǎn)于96孔酶標(biāo)板上，每孔100 μL，37 ℃避光保存2 h；棄去包被液，用洗滌液洗滌1次，拍干后每孔200 μL加入封閉液，37 ℃避光保存2h；棄去封閉液后直接拍干即完成板的包被。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。加入濃度呈梯度的高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和已經(jīng)稀釋成最佳工作濃度的抗體溶液，每孔50 μL，蓋上蓋板膜，在25 ℃避光反應(yīng)30 min后；用洗滌液洗滌四五次，拍干，加入相應(yīng)的酶標(biāo)二抗，每孔100 μL，蓋上蓋板膜，25 ℃避光反應(yīng)30 min后；洗滌四五次，依次加入顯色底物液A液（過氧化脲）、顯色底物B液（四甲基聯(lián)苯胺），每孔加 50 μL，25 ℃顯色 15 min，每孔加入 100 μL 2 mol/L H2SO4終止液，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定每孔吸光度值（OD值）。記錄數(shù)據(jù)，用RIDASCREEN軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別選擇標(biāo)準(zhǔn)品濃度0、5、15、45、135 ng/mL和405 ng/mL 6個(gè)梯度，以濃度為0 ng/L時(shí)的OD值為B0值，相應(yīng)濃度的高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為B值，以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 樣本前處理方法的建立

（1）蘋果前處理方法。用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱?。?.0±0.05）g均質(zhì)后的蘋果樣本到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入5 mL提取劑，用渦旋儀渦動(dòng)5 min；室溫（20～25 ℃）4 000 r/min離心5 min；取上清液50 μL，加入到950 μL復(fù)溶液中，充分混勻，分析時(shí)每孔取50 μL點(diǎn)于酶標(biāo)板中。

（2）大豆前處理方法。稱?。?.0±0.05）g經(jīng)勻漿機(jī)均質(zhì)后的大豆樣本到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入5 mL提取劑，用渦旋儀渦動(dòng)5 min；室溫（20～25 ℃）4 000 r/min離心5 min；取上清液50 μL，加入到950 μL復(fù)溶工作液中，充分混勻，分析時(shí)每孔取50 μL點(diǎn)于酶標(biāo)板中。

（3）蓮花白前處理方法。用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱?。?.0±0.05）g均質(zhì)后的蔬菜樣本到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入5 mL提取劑，用渦旋儀渦動(dòng)5 min；室溫（20～25 ℃）4 000 r/min離心5 min；取上清液50μL，加入到950 μL復(fù)溶液中，充分混勻，分析時(shí)每孔取50 μL點(diǎn)于酶標(biāo)板中。

1.3.8 試劑盒各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)的確立

（1）樣本檢測(cè)限試驗(yàn)。一定條件下，試劑盒方法檢測(cè)限（MDL）可用正態(tài)分布規(guī)律來表，因此可用20個(gè)空白樣本通過試劑盒測(cè)定的光密度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的高效氯氟氰菊酯濃度的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）來表示，MDL=+3S。

（2）準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)。以3個(gè)不同濃度的高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品分別對(duì)空白蘋果、大豆、蓮花白樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和變異系數(shù)。

式中，Cx為添加了一定高效氯氟氰菊酯含量的樣本經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析得到的實(shí)際濃度，μg/kg；C0為添加空白樣本經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析得到的實(shí)際濃度，μg/kg；C為添加實(shí)際添加的高效氯氟氰菊酯濃度，μg/kg。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。將一定量的試劑盒分為數(shù)批保存于4 ℃環(huán)境中，每隔1個(gè)月取出一批，分別測(cè)定其相應(yīng)零標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、IC50，同時(shí)做添加回收實(shí)驗(yàn)測(cè)得回收率，依試驗(yàn)結(jié)果對(duì)試劑盒的穩(wěn)定性進(jìn)行判定；同時(shí)將試劑盒進(jìn)行加速老化試驗(yàn)，每隔1 d取出進(jìn)行測(cè)定，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止。通常在37 ℃進(jìn)行的加速老化實(shí)驗(yàn)顯示每穩(wěn)定1 d，可相當(dāng)于4～10 ℃保存45 d，以此來確定試劑盒異常條件所能保存的時(shí)間。

（4）可靠性試驗(yàn)。隨機(jī)抽取蘋果、大豆、蓮花白各20份，用本試劑盒方法與國家標(biāo)準(zhǔn)中的氣相色譜法分別對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)對(duì)比結(jié)果驗(yàn)證試劑盒檢測(cè)實(shí)際樣本的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳工作濃度的選擇

不同包被原和單克隆抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方陣法測(cè)定結(jié)果（OD450值）見表1。在包被過程中，包被效果與濃度成正比，但如果濃度過高，待測(cè)物的競(jìng)爭(zhēng)能力將會(huì)減弱，靈敏度也會(huì)受到影響，同時(shí)會(huì)造成抗原的浪費(fèi)，而酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值的敏感范圍在1.00左右，綜上所述，根據(jù)表中結(jié)果，試驗(yàn)的最佳選擇為包被原稀釋倍數(shù)為4.5×104，最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶25 000。

表1 不同包被原和單克隆抗體稀釋濃度的OD450值表

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)建議的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，選擇高效氯氟 氰菊 酯 標(biāo) 準(zhǔn) 品 濃 度0、5、15、45、135 ng/mL和405 ng/mL，以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。其中相關(guān)系數(shù)R2=0.9984，IC50為28.8 μg/L。

圖3 高效氯氟氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 試劑盒各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)的確定

2.3.1 樣本檢測(cè)限試驗(yàn)由表2可知，根據(jù)MDL=+3S，得到試劑盒方法對(duì)蘋果、玉米、白菜樣本的檢測(cè)限分別為9.25、13.94、43.37 μg/kg。

表2 高效氯氟氰菊酯試劑盒方法檢測(cè)限表

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

ELISA測(cè)定的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)表示。取空白蘋果、大豆、蓮花白樣本，按表2所述的高效氯氟氰菊酯添加濃度對(duì)其進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，用3個(gè)批次的試劑盒測(cè)定，各計(jì)算出回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)，見表3。

表3 高效氯氟氰菊酯試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度表

由表3可知，以3個(gè)不同濃度的高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)空白蘋果、大豆、蓮花白樣本進(jìn)行添加，其加標(biāo)回收率范圍為68.8%～105.3%，說明試劑盒準(zhǔn)確度較好；批內(nèi)變異系數(shù)范圍為7.1%～13.2%，批間變異系數(shù)范圍為7.9%～13.1%，均小于15%，說明試劑盒精密度以及重復(fù)性較好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將試劑盒分別放置于4 ℃和37 ℃，每隔一定時(shí)間取出，根據(jù)試劑盒的靈敏度和回收率等參數(shù)，判斷其穩(wěn)定性。經(jīng)測(cè)定，該試劑盒能在37℃條件下穩(wěn)定保存9 d，第10 d開始各項(xiàng)參數(shù)開始下降，而在4 ℃條件下至少保存15個(gè)月仍可保持靈敏度和回收率等參數(shù)。

2.3.4 可靠性試驗(yàn)

通過試劑盒方法和儀器方法對(duì)隨機(jī)抽取的蘋果、大豆、蓮花白樣本進(jìn)行測(cè)定，蘋果、大豆、蓮花白樣本的陽性判定限分別為20、30、60 μg/kg，結(jié)果篩選出1份陽性蘋果樣本和3份陽性蓮花白樣本，比較結(jié)果見表4。

表4 ELISA法和GC法檢測(cè)結(jié)果比較表（單位：μg/kg）

由表4可知，對(duì)高效氯氟氰菊酯殘留的測(cè)定用ELISA法和GC法的測(cè)定結(jié)果基本一致，符合度達(dá)到99%以上。

3 結(jié)論

高效氯氟氰菊酯很耐雨水沖刷，從而易殘留在農(nóng)產(chǎn)品中，甚至被農(nóng)產(chǎn)品吸收。人們攝取這些殘留了高效氯氟氰菊酯的蔬菜以后，極易在人體中大量富集，影響人們的身體健康，而目前，高效氯氟氰菊酯在水稻、蔬菜、果樹等農(nóng)作物中還在廣泛使用，非常有必要對(duì)其含量進(jìn)行監(jiān)控，保障人民的身體健康，這就決定了在人們經(jīng)常獲取農(nóng)產(chǎn)品的菜場(chǎng)、超市等場(chǎng)所必須有一定力度的農(nóng)藥殘留抽檢工作，若用儀器方法進(jìn)行抽檢，雖然檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度都非常高，可是單個(gè)樣品的檢測(cè)所用時(shí)間較長(zhǎng)，而且需要專門的人負(fù)責(zé)檢測(cè)工作，這就造成了檢測(cè)效率低下的后果，非常不利于廣泛的推廣使用，而ELISA試劑盒則不需要專業(yè)的人員進(jìn)行操作，稍微進(jìn)行培訓(xùn)就可以進(jìn)行檢測(cè)工作，甚至可用于商家自身對(duì)產(chǎn)品的檢測(cè)，由于其單個(gè)樣品檢測(cè)所用的時(shí)間較短，所以通常用于大批量的樣品進(jìn)行抽檢，檢測(cè)的靈敏度和儀器方法幾乎一致，是一種值得信賴的檢測(cè)方法。

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