NRAMP1基因3′UTR多態(tài)性位點(diǎn)與白族肺結(jié)核易感相關(guān)性研究

王桂花，何連福

（大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南大理 671000）

結(jié)核?。╰uberculosis）是結(jié)核分枝桿菌（myco?bacterium tuberculosis，MTB）感染而引起的一種慢性傳染病，病變常累及胸膜、肺臟、脊柱、腸道等多個(gè)組織器官，以肺結(jié)核（pulmonary tuberculosis）最為常見。2016年，全球約1 040萬新發(fā)結(jié)核病例，死亡率22%，是全世界第十大死因，在傳染性疾病中排名第一〔1〕。引起結(jié)核病的因素有營養(yǎng)不良、環(huán)境因素、遺傳因素等，隨著結(jié)核病發(fā)病機(jī)制研究的深入及分子診斷技術(shù)的發(fā)展，遺傳因素誘發(fā)結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展越來越受到關(guān)注。相關(guān)研究表明，遺傳因素在結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展中起到一定的作用〔2〕。與結(jié)核病易感的相關(guān)基因有VDR、MBL、NRAMP1（自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1）、Sp110、TLR2、HLA等〔3-8〕。

NRAMP1基因，又稱SLC11A1（溶質(zhì)載體家族11成員1）基因，位于人類染色體2q35，全長14 Kb，編碼550個(gè)氨基酸。大量研究發(fā)現(xiàn)非洲、亞洲、歐洲結(jié)核病易感性與NRAMP1的D543N、3′UTR、5′（GT）n、INT4這4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)有關(guān)，且不同種族的人群均存在差異〔9-10〕。云南大理是少數(shù)民族的聚居地，而少數(shù)民族中白族人群居多。目前有關(guān)大理白族人群結(jié)核病易感相關(guān)基因的研究尚未見報(bào)道，本研究采用病例—對(duì)照研究及PCR-RFLP方法，探究NRAMP1基因的3′UTR位點(diǎn)多態(tài)性與大理白族人群肺結(jié)核易感的相關(guān)性，并觀測(cè)患者抗結(jié)核治療后發(fā)生不良反應(yīng)的情況，為世居大理白族人群結(jié)核病易感性的評(píng)估及防治提供遺傳基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 病例組選取2015年3月至2017年10月在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科確診的白族活動(dòng)性肺結(jié)核患者共193例，平均年齡（39.98±14.55）歲，男性108例，女性85例，所有患者均符合2008年中華人民共和國衛(wèi)生部制定的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組選取同期白族健康體檢人員191人，平均年齡（37.62±10.68）歲，男性111人，女性80人。病例組及對(duì)照組在性別及年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè) 采集研究對(duì)象外周靜脈血2～3 mL。采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取總DNA。用ND2000超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的總DNA進(jìn)行濃度測(cè)定及純度分析，A260∕A280＞1.8及 A230∕A260＞1.7，提示提取的DNA合格。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與電泳 引物設(shè)計(jì)：參照NCBI中NRAMP1全基因序列號(hào)（NG_012128.1），用premier5.0軟件設(shè)計(jì)及由金斯瑞公司合成。PCR反應(yīng)體系25μL：ddH2O 9.5 μL，2× PCR mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL。見表1。

1.2.3 PCR?RFLP分析 PCR產(chǎn)物用Fok1內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系30 μL：PCR產(chǎn)物2 μL，F(xiàn)ok1內(nèi)切酶 1 μL，ddH2O 24 μL，10×酶切 Buffer 3 μL，37℃酶切4 h。取產(chǎn)物上樣，2%瓊脂糖凝膠140 V電泳30 min，分析基因型。見表2。

表1NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)引物及PCR反應(yīng)參數(shù)

表2NRAMP1基因3′UTR多態(tài)性分析

病例組患者抗結(jié)核治療1月后檢測(cè)血常規(guī)、肝腎功能，觀察病例組各基因型患者不良反應(yīng)的發(fā)生率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Hardy-Weinberg遺傳平衡分析對(duì)照組，并評(píng)估其人群代表性。使用軟件SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以O(shè)R值（比值比）及95%可信區(qū)間評(píng)估基因多態(tài)性對(duì)肺結(jié)核發(fā)病的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。

2 結(jié)果

2.1 NRAMP1基因3′UTR多態(tài)性分析

2.1.1 PCR產(chǎn)物 圖1A中，2～3為對(duì)照組PCR產(chǎn)物，5～6為病例組PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增條帶大小為244 bp，與表1中的目的片段大小一致，提示設(shè)計(jì)的引物良好，可進(jìn)行PCR反應(yīng)及后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 酶切產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)Fok1酶酶切后，據(jù)表2分析3′UTR位點(diǎn)多態(tài)性，比對(duì)PCR產(chǎn)物（見圖1A），可確定各樣品3′UTR的基因型（見圖1B）。GG型：7和8為病例組，10為對(duì)照組；GA型：6為病例組，9為對(duì)照組；AA型：1～3為病例組，4和5為對(duì)照組。

圖1 電泳圖譜

3′UTR位點(diǎn)基因型頻率及等位基因在兩組間的分布見表3。病例組中，GG基因型占66.32%，GA基因型占27.98%，AA基因型占5.70%；對(duì)照組中，GG基因型占82.20%，GA基因型占15.71%，AA基因型占2.10%。病例組中GA型和AA型明顯多于對(duì)照組（P＜0.05）。A等位基因在病例組的分布明顯高于對(duì)照組（P＜0.001）。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提示，A等位基因（OR=2.219，95%CI=［1.470-3.349］）是白族人群肺結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

表3 NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)等位基因及基因型分布［n（%）］

不同遺傳模式下兩組間3′UTR位點(diǎn)的基因型分布見表4。顯性遺傳模式下，3′UTR位點(diǎn)可分為GG、GA+AA，病例組中GA+AA基因型頻率明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。以GG基因型為對(duì)照，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果顯示白族人群中存在GA+AA基因型的個(gè)體肺結(jié)核的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高（OR=2.345，95%CI=［1.466-3.751］）；隱性遺傳模式下，3′UTR位點(diǎn)可分為GA+GG、AA，AA基因型頻率在兩組間的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；加性遺傳模式下，3′UTR位點(diǎn)可分為GG、GA和AA，GA和AA基因型頻率在病例組中明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），以GG基因型為對(duì)照，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果提示白族人群中AA及GA基因型個(gè)體患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)增大（OR=3.373，95%CI=［1.114-10.210］；OR=2.208，95%CI=［1.343-3.630］）。表明白族人群中NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核病相關(guān)，3′UTR位點(diǎn)突變?cè)黾恿嘶挤谓Y(jié)核的概率。

表4 不同遺傳模式下NRAMP1基因3′UTR多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布［n（%）］

2.2 NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)基因型分布與不良反應(yīng)的相關(guān)性 193例患者出現(xiàn)199例次不良反應(yīng)，包括胃腸道反應(yīng)、肝損害、關(guān)節(jié)損害、神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)、過敏反應(yīng)、血液系統(tǒng)反應(yīng)、腎損害等。從表5可知，各種不良反應(yīng)在3種基因型中發(fā)生的情況，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從表6得出，野生型（GG型）與突變型（GA+AA型）患者抗結(jié)核治療后不良反應(yīng)的發(fā)生情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 NRAMP1 3′UTR位點(diǎn)基因型分布與不良反應(yīng)嚴(yán)重性的關(guān)系 50例次發(fā)生的較重不良反應(yīng)須進(jìn)行臨床處理，常見胃腸道反應(yīng)、肝損傷、過敏反應(yīng)及血液系統(tǒng)等癥狀。GG型與GA+AA型患者間須臨床治療不良反應(yīng)的發(fā)生情況無明顯區(qū)別（P＞0.05），見表7。臨床處理后，不良癥狀減輕或消退，未見因不良反應(yīng)而不耐受停藥者。

3 討論

本文采用病例—對(duì)照研究及PCR-RFLP方法，研究NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)多態(tài)性與大理白族肺結(jié)核易感相關(guān)性，并分析各基因型與肺結(jié)核抗結(jié)核治療后的不良反應(yīng)相關(guān)性。3′UTR位點(diǎn)多態(tài)性分析結(jié)果顯示，病例組中突變型（GA型和AA型）明顯多于對(duì)照組（P＜0.05）；等位基因分析結(jié)果表明，A等位基因（OR=2.219，95%CI=［1.470-3.349］）是白族人群肺結(jié)核病發(fā)病的危險(xiǎn)因素；顯性遺傳模式下，病例組中GA+AA基因型分布顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提示存在GA+AA基因型的白族個(gè)體患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)增高（OR=2.345，95%CI=［1.466-3.751］）；隱性遺傳模式下，兩組間AA基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；加性遺傳模式下，突變基因型在病例組中的分布顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估顯示具有GA和AA基因型的白族個(gè)體易患肺結(jié)核（OR=2.208，95%CI=［1.343-3.630］；OR=3.373，95%CI=［1.114-10.210］）。結(jié)果表明白族人群的NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)突變會(huì)引起肺結(jié)核的患病率增加及加劇病情的惡化。1998年，Bellarmy等〔11〕以西非人群為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)NRAMP1基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)［5′（CA）n、INT4、D543N和3′UTR］與結(jié)核病易感性相關(guān)；安雅臣等〔12〕以中國北方漢族人為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)多態(tài)性可能與中國北方漢族人群的肺結(jié)核易感性相關(guān)，且可影響肺結(jié)核病理學(xué)特點(diǎn)。以上研究結(jié)果進(jìn)一步表明NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)突變與肺結(jié)核易感性相關(guān)。

表5 不同基因型肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療中不良反應(yīng)發(fā)生情況［n（%）］

表6 野生型及突變型肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療中不良反應(yīng)發(fā)生情況［n（%）］

表7 NRAMP1基因3'UTR位點(diǎn)不同基因型肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療中須臨床處理不良反應(yīng)的發(fā)生情況［n（%）］

常用的一線抗結(jié)核藥有異煙肼、利福平、乙胺丁醇等，多會(huì)引起胃腸道反應(yīng)、肝損傷等副作用。本文對(duì)病例組患者抗結(jié)核治療后出現(xiàn)不良反應(yīng)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示NRAMP1基因3′UTR位點(diǎn)不同基因型間的副作用發(fā)生率及嚴(yán)重程度均無明顯差異。

本文僅探討了NRAMP1基因?qū)Υ罄戆鬃迦巳航Y(jié)核病易感性的作用，但引發(fā)結(jié)核病的相關(guān)因素很多，如居住條件、營養(yǎng)狀況、細(xì)菌毒力等均增加了結(jié)核病早期防治困難，而關(guān)于結(jié)核病易感相關(guān)基因的研究有利于結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，為其防治提供參考。

〔1〕WORLD HEALTH ORGANIZATION.Global Tuberculosis Report2016〔C〕.Global Tuberculosis Report，2016.

〔2〕WU L S H，LEE S W，HUANG KY，et al.Systematic Ex?pression Profiling Analysis Identifies Specific MicroRNAGene Interactions that May Differentiate between Active and Latent Tuberculosis Infection〔J〕.Biomed Res Int，2014：895179.

〔3〕DE MAGEE M J，SUN Y V，BRUST J C M，et al.Polymor?phisms in the vitamin D receptor gene are associated with reduced rate of sputum culture conversion in multidrug-re?sistant tuberculosis patients in South Africa〔J〕.PLoS ONE，2017，12（7）：e0180916.

〔4〕DE KNEGT G J，DICKINSON L，PERTINEZ H，et al.As?sessment of treatment response by colony forming units，time to culture positivity and the molecular bacterial load assay compared in a mouse tuberculosis model〔J〕.Tuber?culosis，2017，105（5）：113-118.

〔5〕YUAN L Y，KE Z Q，GUO Y，et al.NRAMP1 D543N and INT4 polymorphisms in susceptibility to pulmonary tuber?culosis：A meta-analysis〔J〕.Infect Genet Evol，2017，54：91-97.

〔6〕WU Y Y，GUO Z K，LIU F Y，et al.Sp110 enhances macro?phage resistance to Mycobacterium tuberculosis via induc?ing endoplasmic reticulum stress and inhibiting anti-apop?totic factors〔J〕.Oncotarget，2017，8（38）：64050-64065.

〔7〕ZHANG J W，ZHAO Z Z，ZHONG H Y，et al.Importance of common TLR2 genetic variants on clinical phenotypes and risk in tuberculosis disease in a Western Chinese popu?lation〔J〕.Infect Genet Evol，2018，60：173-180.

〔8〕TIWARI V，KEDIA S，GARG S K，et al.CD4+CD25+FOXP3+T cell frequency in the peripheral blood is a bio?markerthatdistinguishesintestinaltuberculosisfrom Crohn's disease〔J〕.PLoS ONE，2018，13（2）：e0193433.

〔9〕MEDAPATI R V，SUVVARI S，GODI S，et al.NRAMP1 and VDR gene polymorphisms in susceptibility to pulmo?nary tuberculosis among Andhra Pradesh population in In?dia：a case-control study〔J〕.BMC Pulm Med，2017，17：89.

〔10〕FERNáNDEZ-MESTRE M，VILLASMIL á，TAK-IFF H，et al.NRAMP1 and VDR Gene Polymorphisms in Suscepti?bility to Tuberculosis in Venezuelan Population〔J〕.Disease Markers，2015，2015：860628.

〔11〕BELLAMY R，RUWENDE C，CORRAH T，et al.Assess?ment of the interleukin 1 gene cluster and other candidate gene polymorphisms in host susceptibility to tuberculo?sis〔J〕.Tuber Lung Dis，1998，79（2）：83-89.

〔12〕安雅臣，馮福民，袁聚祥，等.NRAMP1基因INT4和3'UTR位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的研究〔J〕.中華流行病學(xué)雜志，2006，27（1）：37-40.