決明子及炒決明子HPLC化學(xué)指紋特征及6種成分的比較研究

鄒 妍，鄢海燕

（1.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650091；2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

決明子是豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Cassia tora L.的干燥成熟種子，有清熱明目、潤腸通便的功效〔1〕，最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》〔2〕。蒽醌類成分是其主要的活性成分，含量較高。大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚及橙黃決明素等在國內(nèi)外研究較多，且都有明顯的藥理活性〔3〕?！吨腥A人民共和國藥典》（2015年版）對決明子和炒決明子以稀鹽酸水解后，以大黃酚和橙黃決明素作為決明子及炒決明子化學(xué)質(zhì)量控制的指標性成分〔1〕。僅以一個或兩個指標成分進行質(zhì)量控制不能全面地反映決明子藥材的內(nèi)在含量，特別是水解處理后決明子及炒決明子中的苷類成分均水解為苷元，無法充分反映決明子及炒決明子的內(nèi)在化學(xué)成分的差異〔4-5〕。為此，本研究采用高效液相色譜法建立12批決明子及炒決明子未水解的化學(xué)指紋圖譜并對決明子及炒決明子中橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚6種成分進行定量分析，以期深入研究決明子炒制前后指紋特征、化學(xué)成分的變化，為進一步提高決明子炮制工藝及質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀（含LC-20A真空在線脫氣機，LC-20AT四元泵，CTO-10AS柱溫箱，SPD-M20A檢測器）；FA2004型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑 橙黃決明素（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：17032405，含量≥98%），蘆薈大黃素（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，批號：L07-140210，含量≥98%），大黃酸（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，批號：D05-140210，含量≥98%），大黃素（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：17032204，含量≥98%），大黃酚（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，批號：D02-140210，含量≥98%），大黃素甲醚（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，批號：D04-140210，含量≥98%）。12批決明子的藥材來源見表1。經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鄒純才副教授鑒定為豆科植物小決明（Cassia tora L.）的干燥成熟種子。炒決明子為實驗室參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）〔1〕自制，即：取決明子，照清炒法〔6〕炒至微鼓起、有香氣。

表1 藥材來源

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 分別取橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，以甲醇溶解，配置質(zhì)量濃度分別為96、176、112、168、148、108 μg∕mL的對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備 決明子及炒決明子粉碎，過40目篩，各取1 g，精密稱定，分別加100 mL二氯甲烷回流80 min，所得二氯甲烷層回收溶劑后，分別以甲醇定容于25 mL容量瓶中，得0.04 g∕mL（每mL含原藥材0.04 g）的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2 色譜條件 色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（流動相A：0～15 min，35%→35%；15～18 min，35%→32%；18～23 min，32%→32%；23～25 min，32%→35%；25～45 min，35%→50%；45～63 min，50%→55%；63～85 min，55%→55%；85～100 min，55%→90%），流速為1.0 mL∕min；柱溫25 ℃；DAD檢測器，檢測波長287 nm，進樣量10 μL。

2.3 相似度計算 采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723版本）進行多點校正、Mark峰及全譜峰匹配、生成對照圖譜并進行相似度計算。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 決明子及炒決明子指紋特征的研究

3.1.1 決明子及炒決明子指紋圖譜 橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚6種成分的混合對照品、決明子及炒決明子樣品的色譜圖，見圖1～3。

圖1 混合對照品的色譜圖

圖2 決明子的HPLC色譜圖

圖3 炒決明子的HPLC色譜圖

3.1.2 決明子及炒決明子共有模式的建立 采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723版本）對12批決明子、炒決明子樣品指紋圖譜進行多點校正、峰匹配、生成對照圖譜，見圖4～5。

3.1.3 相似度評價 采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723版本），對圖4～5中的指紋圖譜進行處理。設(shè)置S1為參照圖譜，經(jīng)多點校正，分別進行全譜峰匹配和Mark峰匹配，生成對照圖譜，計算各樣品與對照圖譜的相似度。見表2。

3.2 決明子及炒決明子6種成分的定量分析

圖4 12批決明子的HPLC指紋圖譜及對照圖譜

圖5 12批炒決明子的HPLC指紋圖譜及對照圖譜

表2 相似度計算結(jié)果（xˉ±s，n=12）

表3 決明子中6種成分的回歸方程

3.2.1 標準曲線的建立 取對照品適量，以甲醇為溶劑分別配制系列混合對照液，并逐步稀釋為5個系列濃度，按照“2.2”項下色譜條件進樣。以對照品溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。見表3。3.2.2 方法學(xué)考察 ①精密度：精密吸取決明子（批號為170401）樣品溶液，按照“2.2”項下色譜條件，連續(xù)進樣5次。結(jié)果顯示橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.38%、1.24%、1.32%、0.49%、0.40%和1.60%，表明儀器精密度良好。

②穩(wěn)定性：取決明子（批號為170425）的樣品溶液，按照“2.2”項下的色譜條件，分別在0、6、12、18、24 h進行測定。結(jié)果橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.33%、1.53%、1.28%、0.46%、0.44%、3.72%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

③重復(fù)性：取決明子（批號為170425）樣品5份，按“2.1.2”項下方法預(yù)處理，按“2.2”項下色譜條件分別進樣。結(jié)果橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚百分含量的RSD分別為2.21%、4.85%、3.30%、3.63%、4.83%、4.44%，表明方法精密度良好。

④加樣回收率：取決明子（批號為170425）的樣品9份，分為3組，每組3份，每組按照橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚已測得含量的80%、100%、120%精密加入對照品。按“2.1.2”項下方法制備溶液，按照“2.2”項下的色譜條件進行測定。見表4。

表4 加樣回收率結(jié)果

續(xù)表4

3.2.3 樣品分析 按“2.1.2”的方法對12批決明子及炒決明子進行處理，按“2.2”項下色譜條件，對12批決明子及炒決明子中橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚進行定量分析，見表5。

表5 決明子及炒決明子6種成分的定量分析（xˉ±s，n=12）

4 討論

在實驗中針對決明子中蒽醌類化合物這一主要有效成分來進行流動相的篩選〔7〕，考察了甲醇、乙腈與磷酸、醋酸的混合系統(tǒng)作為流動相的梯度洗脫條件，并對YMC-Pack ODS-A C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）、Synergi Hydro－RP C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）、Kinetex XB-C1（8100A，250 mm×4.6 mm）、Agilent TC-C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）等幾種色譜柱的分離效果進行了考察，以色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫效果最佳。同時綜合各蒽醌類化合物的紫外吸收特征，選擇檢測波長為287 nm。本實驗中，樣品處理方法參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）〔1〕，但省略了甲醇提取過程并用二氯甲烷代替三氯甲烷進行萃取，降低試劑毒性，同時也滿足決明子及炒決明子未水解處理條件下指紋特征及成分含量比較的要求。

中藥指紋圖譜就其本質(zhì)而言，應(yīng)可視為中藥的一種依賴于不同提取方法所得的活性化學(xué)組分的相對濃度譜〔8〕，為國內(nèi)外廣泛接受的一種中藥質(zhì)量評價模式?！吨腥A人民共和國藥典》（2015年版）及現(xiàn)有研究多對決明子及炒決明子進行水解處理后的樣品進行分析，難以評價決明子及炒決明子內(nèi)在化學(xué)成分上的差異。為此，參考有關(guān)文獻〔10-11〕，本實驗建立了12批決明子及炒決明子未水解樣品的指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12批決明子與決明子對照圖譜及炒決明子對照圖譜比較，相似度分別為0.94和0.67，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；12批炒決明子與炒決明子對照圖譜及決明子對照圖譜比較，相似度分別為0.92和0.62，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。因此，采用指紋圖譜技術(shù)可進行決明子及炒決明子的鑒別。通過實驗結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的決明子間化學(xué)成分有一定差異，因此，應(yīng)按《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和決明子規(guī)范化種植標準操作規(guī)程開展決明子藥材的種植生產(chǎn)，以保證藥材質(zhì)量〔12〕。炒決明子相似度較決明子低，可能原因是決明子本身內(nèi)在化學(xué)成分的差異經(jīng)過炒制后更加凸顯。

本實驗對決明子及炒決明子中的橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等成分的定量分析結(jié)果表明，決明子及炒決明子未經(jīng)水解處理，炒決明子中6種成分的含量均較決明子高，其中大黃素、大黃酚及大黃素甲醚差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或0.05），說明炒制過程中，部分結(jié)合型苷類成分解離成了苷元，應(yīng)注意炒制過程的質(zhì)量監(jiān)控。鑒于決明子及炒決明子未水解樣品中6種成分含量的差異性，特別是與決明子相比，炒決明子中大黃素、大黃酚及大黃素甲醚差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。因此，決明子及炒決明子未水解樣品中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚用于決明子炒制前后內(nèi)在成分含量變化的評價更為合理。

〔1〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：145.

〔2〕侯長軍，張平平，霍丹群.決明子的應(yīng)用研究進展〔J〕.海峽藥學(xué)，2007，19（7）：7-9.

〔3〕王淑紅，楊春娟，劉璐，等.HPLC測定決明子中6種游離蒽醌含量〔J〕.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，49（1）：22-26.

〔4〕賴日明.不同炮制方法對決明子中蒽醌類成分含量的影響〔J〕.中國民族民間醫(yī)藥，2015，24（20）：5.

〔5〕寇真真.炮制對決明子主要成分及藥效影響研究〔D〕.鄭州：河南中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

〔6〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：31.

〔7〕李文莉，黃曉燕，丁野，等.不同來源決明子的質(zhì)量分析〔J〕.藥物分析雜志，2013，33（8）：1411-1415.

〔8〕謝培山.中藥色譜指紋圖譜〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：141.

〔9〕羅國安，粱瓊麟，王義明.中藥指紋圖譜—質(zhì)量評價、質(zhì)量控制與新藥研發(fā)〔M〕.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：18.

〔10〕楊美麗，張少杰，楊金蕊，等.決明子的特征圖譜研究及質(zhì)量分析〔J〕.中國藥業(yè)，2015，24（22）：75-78.

〔11〕張杰，張振秋，米寶麗，等.HPLC測定不同來源決明子飲片中9個成分的含量〔J〕.藥物分析雜志，2013，33（10）：1665-1671.

〔12〕張成，李勇軍，李永，等.決明子規(guī)范化種植標準操作規(guī)程（SOP）〔J〕.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2015，29（2）：5-7.