云南泡核桃殼提取物體外抗肝纖維化活性研究

李春艷，陳進(jìn)汝，董壽堂，劉 熙，郝芳芳，李冬梅，李丹丹

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南大理 671000）

肝臟疾病包括慢性肝炎、酒精脂肪肝、肝纖維化、肝硬化和肝癌。肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理過(guò)程，其最終發(fā)展為肝硬化，更是肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）的前兆〔1〕。肝纖維化是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM，以膠原蛋白為主要成分）的合成與代謝失調(diào)的結(jié)果，導(dǎo)致肝內(nèi)膠原過(guò)多或異常的膠原纖維沉積的病理狀態(tài)及相關(guān)改變，引起肝內(nèi)、外循環(huán)障礙，影響肝細(xì)胞與血液之間的物質(zhì)交換〔2〕。在各種參與肝纖維化的細(xì)胞中，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)〔3〕，活化的HSC一方面合成分泌大量的膠原蛋白（膠原蛋白水解酶活性被抑制），導(dǎo)致ECM合成降解失衡而大量沉積于組織間隙中；另一方面，活化的HSC通過(guò)自分泌方式異常合成轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），合成的TGF-β1又作用于鄰近的HSC，啟動(dòng)HSC活化〔4-5〕。持續(xù)的HSC激活導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生改變，由原有的HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞而導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，即肝纖維化病變〔6〕。故能抑制HSC增殖，減少Ⅰ型膠原（ColⅠ）、III型膠原（ColⅢ）的含量，可作為藥物治療肝纖維化的靶點(diǎn)，加之臨床研究和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肝纖維化通過(guò)積極有效的治療可以逆轉(zhuǎn)，從而提高患者生存率和改善生活質(zhì)量，但發(fā)展到肝硬化階段則很難逆轉(zhuǎn)。因此，防治肝纖維化是治療的關(guān)鍵。

云南泡核桃主產(chǎn)于云南漾濞地區(qū)，為漾濞泡核桃（Juglans sigillata D.）系胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）植物的成熟果實(shí)。該核桃屬植物具有抗腫瘤、消炎、鎮(zhèn)痛〔7-11〕及抗氧化〔12-13〕等藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，HSC活化、增殖及膠原合成與氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)〔14〕。如有文獻(xiàn)報(bào)告，ROS能夠?qū)е翲SC的活化增殖〔15〕。同時(shí)研究表明〔16〕脂質(zhì)過(guò)氧化物3壬?。℉NE）能促使MAPK活化，提高PDGF受體結(jié)合活性，進(jìn)而導(dǎo)致HSC的活化，促進(jìn)肝纖維化。另外，持續(xù)的炎癥也是導(dǎo)致肝纖維化的重要因素。因此具有抗炎抗氧化的藥物對(duì)肝纖維化本身就有治療效果。鑒于以上理論依據(jù)，加之未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)告云南泡核桃殼抗肝纖維化作用，故本文考察云南泡核桃殼對(duì)HSC增殖的影響，及其對(duì)正常人肝細(xì)胞（L-02）的毒性作用，以篩選出活性高、毒性小的抗肝纖維化提取物，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)云南泡核桃殼提取物干預(yù)下HSC培養(yǎng)上清中TGF-β1、ColⅠ、ColⅢ的含量，初步探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 云南漾濞泡核桃殼提取物及得率 本實(shí)驗(yàn)所用樣品采于云南大理漾濞縣，經(jīng)大理大學(xué)生藥教研室夏從龍教授鑒定為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）植物云南泡核桃（Juglans sigillata D.）的成熟果實(shí)。HTK-D：醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液，一倍醇溶后得到（得率為0.20%）；HTK-F：濾液兩倍醇溶得到的濾液再五倍醇溶得到的沉淀HTK-F（得率為0.21%）；HTK-DEF：醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液，一次五倍醇溶，過(guò)濾，得沉淀HTK-DEF（得率為0.70%）。

1.2 細(xì)胞株 HSC、L-02均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.3 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS均購(gòu)自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶（Thermo公司）；噻唑藍(lán)（MTT）、Hepes、雙抗（青霉素100 mg∕L，鏈霉素100 mg∕L）、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自Sigma公司；秋水仙堿（西雙版納版納藥業(yè)有限公司，批號(hào)：07010）；TGF-β1檢測(cè)試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；膠原檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Bio-Tek）；Es-315高壓滅菌器（日本Tomykogyo）；Yj-1450無(wú)菌操作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；微量移液器（Gilson）；IX-7倒置相差顯微鏡（Olympus）；水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞接種HSC用完全培養(yǎng)基 （含10%滅活FBS的DMEM）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化、離心后，棄去上清液，完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至1×105個(gè)∕mL，100 μL∕孔接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

2.2 云南泡核桃殼提取物對(duì)HSC增殖的影響 將已培養(yǎng)HSC細(xì)胞12 h的培養(yǎng)板，棄去上清液，分別于每孔加入濃度梯度HTK-D、HTK-F、HTK-DEF樣品溶液，終濃度為1 000.00、250.00、62.50、15.63、3.91、0.98 μg∕mL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（秋水仙堿）、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，棄去上清液，每孔加入20 μL MTT（5 mg∕mL）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μL∕孔DMSO溶液，紫色結(jié)晶溶解后，在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔OD值，按下式計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=［1-（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）（∕OD陰性-OD空白）］×100%

2.3 云南泡核桃殼提取物對(duì)L-02細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

棄去已培養(yǎng)12 h的L-02細(xì)胞培養(yǎng)板上清液，待測(cè)樣品的加入和對(duì)照同“2.2”。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，棄去上清液，每孔加入5 mg∕mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO溶液150 μL∕孔，待紫色結(jié)晶溶解后，在波長(zhǎng)490 nm檢測(cè)各孔OD值，按下式計(jì)算出存活率。

存活率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）（∕OD陰性-OD空白）×100%

2.4 ELISA法檢測(cè)TGF-β1含量 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。顯色后，以空白孔調(diào)零，在波長(zhǎng)490 nm處讀取OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)得的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出云南泡核桃殼提取物上清中TGF-β1的相應(yīng)濃度。

2.5 ELISA法檢測(cè)ColⅠ、ColⅢ含量 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品組、樣品組（云南泡核桃殼提取物HTK-D、HTK-F、HTK-DEF）及空白組，顯色后，以空白孔調(diào)零，在波長(zhǎng)490 nm處讀取OD值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)得的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出ColⅠ、ColⅢ含量的相應(yīng)濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，各組間均數(shù)比較采用方差齊性檢驗(yàn)后單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 云南泡核桃殼提取物對(duì)HSC增殖的影響 肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是HSC的激活，HSC的過(guò)度激活、增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵。故抑制HSC的增殖，是目前研發(fā)抗肝纖維化藥物的靶點(diǎn)之一。從表1中實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：從24 h到48 h，隨著云南泡核桃殼提取物與HSC作用時(shí)間的延長(zhǎng)，云南泡核桃殼各提取物平行濃度下的抑制作用增強(qiáng)。與陰性對(duì)照組比較，24 h時(shí)，HTK-D、HTK-F分別在1 000.00、250.00 μg∕mL時(shí)對(duì)HSC增殖的抑制差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HTK-DEF僅在1 000.00 μg∕mL時(shí)對(duì)HSC增殖的抑制差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；48 h時(shí)，HTK-D、HTK-DEF在15.63 μg∕mL至1 000.00 μg∕mL時(shí)抑制HSC增殖差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HTK-F對(duì)HSC增殖的抑制差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的濃度范圍為 62.5～1 000.00 μg∕mL。云南泡核桃殼各提取物與HSC孵育至72 h時(shí)，云南泡核桃殼提取物對(duì)HSC細(xì)胞增殖的抑制作用并不隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，由此可得出抑制HSC增殖作用較好的時(shí)間點(diǎn)為云南泡核桃殼各提取物與HSC細(xì)胞作用48 h。

表1 云南泡核桃殼提取物對(duì)HSC細(xì)胞增殖作用（xˉ±s，n=3）

3.2 云南泡核桃殼提取物對(duì)L-02細(xì)胞的毒性作用

由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)靶細(xì)胞HSC治療的抗肝纖維化藥物不能有效地被攝取及無(wú)細(xì)胞選擇性，可能影響其他組織器官正常的生理功能而引起無(wú)法預(yù)期的嚴(yán)重副作用，故實(shí)驗(yàn)中考察云南泡核桃殼提取物對(duì)L-02的毒性作用，以期篩選出活性高、毒性小的抗肝纖維化活性提取物。根據(jù)“3.1”得出的結(jié)果，云南泡核桃殼提取物與HSC細(xì)胞作用48 h時(shí)，抑制HSC增殖作用較好，故考察HTK-D、HTK-F、HTK-DEF分別與人正常細(xì)胞L-02細(xì)胞作用48 h后，對(duì)L-02細(xì)胞的毒性作用。從表2中的結(jié)果可知，云南泡核桃殼提取物HTK-D與L-02細(xì)胞作用48 h 后，在1 000.00 μg∕mL時(shí)，仍有50%以上的L-02細(xì)胞存活，其CC50＞1 000.00 μg∕mL。云南泡核桃殼提取物HTK-F、HTK-DEF對(duì)L-02細(xì)胞的CC50分別為354.73、457.09 μg∕mL。

表2 云南泡核桃殼提取物對(duì)L-02細(xì)胞的毒性作用（xˉ±s，n=3）

3.3 云南泡核桃殼提取物對(duì)TGF-β1的作用 在肝纖維化過(guò)程中，TGF-β被認(rèn)為是一類重要的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控因子，尤其是其亞型TGF-β1，被證實(shí)參與多種纖維化病變發(fā)生發(fā)展〔17〕。故在實(shí)驗(yàn)中考察云南泡核桃殼提取物對(duì)TGF-β1生成的影響。云南泡核桃殼各提取物與HSC細(xì)胞作用48 h后，收集上清，ELISA法檢測(cè)其上清中TGF-β1的含量，與陰性對(duì)照組比較，HTK-D、HTK-F、HTK-DEF在 62.50、250.00、1 000.00 μg∕mL時(shí)均能降低HSC通過(guò)自分泌方式異常生成TGF-β1（P＜0.05），以1 000.00 μg∕mL時(shí)的作用較顯著（P＜0.01）且呈濃度依賴性。見(jiàn)表3。

3.4 云南泡核桃殼提取物對(duì)I型膠原、III型膠原的作用 活化的HSC細(xì)胞合成分泌大量的膠原蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成降解失衡而大量沉積于組織間隙中，實(shí)驗(yàn)中采用ELISA法檢測(cè)云南泡核桃殼提取物與HSC作用48 h后培養(yǎng)上清中Col I、Col III的含量。從表4中數(shù)據(jù)可知，與陰性對(duì)照組比較，HTK-D、HTK-F、HTK-DEF分別在各濃度梯度下均能減少Col I、Col III的生成（P＜0.05，P＜0.01），且均呈濃度依賴性。

4 討論

我國(guó)慢性肝炎患者數(shù)千萬(wàn)，是病毒性肝炎流行高發(fā)區(qū)，加上某些有毒物質(zhì)或藥源性所致的肝損傷，都有可能發(fā)生肝纖維化。目前學(xué)者普遍認(rèn)為，肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展模式為急性→慢性→肝纖維化→肝硬化→肝癌，肝硬化為不可逆階段，而肝纖維化為一動(dòng)態(tài)過(guò)程，屬可逆病變〔6，18〕，故尋找高效的抗肝纖維化藥物，阻斷肝纖維化向肝細(xì)胞癌惡性演變，是治療各種肝病的根本目標(biāo)。肝纖維化是繼發(fā)于各種原因引起的肝臟炎癥或損傷后組織修復(fù)過(guò)程中的代償反應(yīng)，以肝臟ECM過(guò)度沉積及分布異常為病理特征〔19〕。在肝纖維化過(guò)程中，調(diào)控肝臟ECM沉積的重要細(xì)胞是HSC，且HSC細(xì)胞的過(guò)度激活、增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：48 h時(shí)云南泡核桃殼提取物HTK-D、HTK-F、HTK-DEF均能抑制HSC的增殖，HTK-D、HTK-F在1 000.00 μg∕mL下抑制HSC增殖的抑制率分別為（60.28±0.01）%、（67.37±0.01）%，提示醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液，一倍醇溶后得到HTK-D、濾液兩倍醇溶得到的濾液再五倍醇溶得到的沉淀HTK-F并不隨著醇溶倍數(shù)的增加而使得活性成分的含量降低而影響其抑制HSC增殖的作用，改變提取工藝經(jīng)醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液，一次五倍醇溶，過(guò)濾，得沉淀HTK-DEF，在1 000.00 μg∕mL時(shí)對(duì)HSC增殖的抑制率為（59.02±0.01）%，與HTK-D、HTK-F在1 000.00 μg∕mL的抑制率相差不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)提示云南泡核桃殼提取物不同提取工藝得到HTK-D、HTK-F、HTK-DEF中均含有抑制HSC細(xì)胞增殖的活性成分。在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)還考察云南泡核桃殼提取物對(duì)正常人肝細(xì)胞的毒性作用，以篩選出活性高、毒性小的抗肝纖維化提取物。在云南漾濞泡核桃殼提取物中，HTK-D對(duì)L-02細(xì)胞毒性小，CC50＞1 000.00 μg∕mL，而HTK-F、HTK-DEF均對(duì)L-02細(xì)胞有一定的毒性作用，其CC50分別為354.73、457.09 μg∕mL?？芍?，云南泡核桃殼提取工藝不同影響其毒性作用的大小。

表3 48 h云南泡核桃殼提取物對(duì)TGF-β1的抑制作用（xˉ±s，n=3）

表4 48 h云南泡核桃殼提取物對(duì)ColⅠ、ColⅢ的影響（xˉ±s，n=3）

TGF-β1可激活HSC合成ECM，抑制肝細(xì)胞再生，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活更多的HSC細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程，降低TGF-β1表達(dá)和生成，對(duì)緩解肝纖維化形成有著重要意義。實(shí)驗(yàn)中收集云南泡核桃殼各提取物與HSC細(xì)胞作用48 h后的培養(yǎng)上清，采用ELISA法檢測(cè)其上清中TGF-β1的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HTK-D、HTK-F、HTK-DEF在62.50～1 000.00 μg∕mL均能抑制HSC細(xì)胞生成TGF-β1（P＜0.05）且呈濃度依賴性。采用LSD-t統(tǒng)計(jì)分析，得知HTK-D、HTK-F、HTK-DEF之間對(duì)抑制HSC生成TGF-β1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示云南泡核桃殼提取工藝不同對(duì)抑制HSC生成TGF-β1無(wú)影響。

在肝纖維化過(guò)程中，活化的HSC細(xì)胞除通過(guò)自分泌方式異常合成TGF-β1外，還合成分泌大量的膠原蛋白，而膠原蛋白水解酶活性被抑制，導(dǎo)致ECM合成增多，降解減少，進(jìn)而大量沉積于組織間隙中。而肝臟中的ColⅠ、ColⅢ則由HSC細(xì)胞合成。故在實(shí)驗(yàn)中考察云南泡核桃殼提取物對(duì)膠原生成的抑制作用，在HTK-D、HTK-F、HTK-DEF與HSC作用48 h后，收集培養(yǎng)上清用ELISA法檢測(cè)ColⅠ、ColⅢ的含量。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：HTK-D、HTK-F、HTK-DEF在各濃度梯度下均能減少ColⅠ、ColⅢ的生成（P＜0.05，P＜0.01），且均呈濃度依賴性。采用LSD-t統(tǒng)計(jì)分析，HTK-D、HTK-F、HTK-DEF對(duì)抑制HSC生成ColⅠ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)抑制HSC生成ColⅢ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示云南泡核桃殼提取工藝不同對(duì)抑制HSC生成ColⅠ無(wú)影響，但對(duì)抑制HSC細(xì)胞生成ColⅢ有影響，抑制ColⅢ生成作用較好的提取工藝為經(jīng)醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液，一次五倍醇溶，過(guò)濾，得到的沉淀HTKDEF，其次為HTK-F的提取工藝，最后為HTK-D的提取工藝。

綜上所述，云南泡核桃殼提取物HTK-D、HTK-F、HTK-DEF具有抑制HSC細(xì)胞增殖的作用，且HTKD對(duì)L-02細(xì)胞毒性小。云南泡核桃殼3個(gè)提取物物均具有抑制HSC細(xì)胞增殖作用，其作用機(jī)制可能與減少TGF-β1、ColⅠ、ColⅢ的生成作用有關(guān)。云南泡核桃殼較好的抗肝纖維化活性部位為醇提水沉經(jīng)堿提酸沉法后一倍醇溶得到的沉淀即HTK-D。

〔1〕LEE Y A，WALLACE M C，F(xiàn)RIEDMAN S L.Pathobiology of liver fibrosis：a translational success story〔J〕.Gut，2015，64（5）：830-841.

〔2〕O'CONNELL M A，RUSHWORTH S A.Curcumin：poten?tial for hepatic fibrosis therapy?〔J〕.Br J Pharmacol，2008,153（3）：403-405.

〔3〕BANSAL M B.Hepatic stellate cells：fibrogenic，regenera?tive or both?Heterogeneity and context are key〔J〕.Hepa?tol Int，2016，10（6）：902-908.

〔4〕BOLTJES A，VAN MONTFOORT N，BIESTA P J，et al.Kupffer Cells Interact With Hepatitis B Surface Antigen In Vivo and In Vitro，Leading to Proinflammatory Cytokine Production and Natural Killer Cell Function〔J〕.J Infect Dis，2015，211（8）：1268-1278.

〔5〕YOSHIDA K，MURATA M，YAMAGUCHI T，et al.TGF-β∕Smad siganling during hepatic fibro-carcinogenesis（Re?view）〔J〕.Int J Oncol，2014，45（4）：1363-1371.

〔6〕KARIN D，KOYAMA Y，BRENNER D，et al.The charac?teristics of activated portal fibroblasts∕myofibroblasts in liv?er fibrosis〔J〕.Differentiation，2016，92（3）：84-92.

〔7〕WANG R J，WANG S，XIA Y G，et al.Antitumor effects and immune regulation activities of a purified polysaccha?ride extracted from Juglan regia.〔J〕.Int J Biol Macromol，2015，72：771-775.

〔8〕XU H L，YU X F，QU S C，et al.Juglone，isolated from Jug?lans mandshurica Maxim，induces apoptosis via down-regu?lation of AR expression in human prostate cancer LNCaP cells〔J〕.Bioorg Med Chem Lett，2013，23（12）：3631-3634.

〔9〕ZHANG W，LIU A H，LI Y，et，al.Anticancer activity and mechanism of juglone on human cervical carcinoma HeLa cells〔J〕.Can J Physiol Pharmacol，2012，90（11）：1553-1558.

〔10〕ZHANG Y L，CUI Y Q，ZHU J Y，et al.The Anti-Tumor Effect and Biological Activities of the Extract JMM6 from theStem-BarksoftheChinese JuglansmandshuricaMaxim on Human Hepatoma Cell Line Bel-7402〔J〕.Afr J Tradit Complement Altern Med，2012，10（2）：258-269.

〔11〕侯甲福，梁憶紅，雷濤，等.核桃楸皮提取物的體外抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32（4）：15-17.

〔12〕PARK G，JANG D S，OH M S.Juglans mandshurica leaf extract protects skin fibroblasts from damage by regulating the oxidative defense system〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2012，421（2）：343-348.

〔13〕LIU L J，LI W，SASAKI T，et al.Juglanone，a novel α-te?tralonyl derivative with potent antioxidant activity from Juglans mandshurica〔J〕.J Nat Med，2010，64（4）：496-499.

〔14〕EWIDA S F，ABDOU A G，El-RASOL ELHOSARY A A，et al.Hepatocyte-like Versus Mesenchymal Stem Cells in CCl4-induced Liver Fibrosis〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2016，25（10）：736-745.

〔15〕HERNANDEZ-GEA V，F(xiàn)RIEDMAN S L.Pathogenesis of Liver Fibrosis〔J〕.Annu Rev Pathol，2011，6：425-456.

〔16〕CHEN Q，CHEN L Y，KONG D S，et al.Dihydroartemis?inin alleviates bile duct ligation-induced liver fibrosis and hepatic stellate cell activation by interfering with the PDGF-βR∕ERK signaling pathway〔J〕.Int Immunophar?macol，2016，34：250-258.

〔17〕O'CONNOR J W，GOMEZ E W.Biomechanics of TGFβinduced epithelial-mesenchymal transition：implications for fibrosis and cancer〔J〕.Clin Transl Med，2014，3：23.

〔18〕MONTANO-LOZA A J，THANDASSERY R B，CZAJA A J，et al.Targeting Hepatic Fibrosis in Autoimmune Hepa?titis〔J〕.Dig Dis Sci，2016，61（11）：3118-3139.

〔19〕LEITA～O H S，DOBLAS S，GARTEISER P，et al.Hepatic Fibrosis，Inflammation，and Steatosis：Influence on the MR Viscoelastic and Diffusion Parameters in Patients with Chronic Liver Disease〔J〕.Radiology，2017，283（1）：98-107.