鏈霉菌30702的鑒定及其生防特性

叢子文 焦敬華 周雙清 黃東益 吳文嬙 許云 夏薇 張榮萍 黃小龍

（海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海口 570228）

鏈霉菌屬（Streptomyces）是放線菌中最大的一類成員，也是產(chǎn)抗生素最多的放線菌菌屬［1］。目前鏈霉菌屬有效發(fā)表種823個(gè)，亞種38個(gè)（http://www.bacterio.net/streptomyces.html）。鏈霉菌屬有效發(fā)表種的模式菌株在16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上分散歸簇于不同的進(jìn)化分枝（Clade）［2］，每個(gè)clade中的菌株大多具有相似的表型和基因型特征以及生物活性，但又存在種間的區(qū)別。紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝（Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gene clade）是其中一個(gè)重要的分枝，由Sembiring 等［3］推薦建立，當(dāng)前包含26個(gè)有效發(fā)表種［4］。該進(jìn)化分枝的放線菌普遍產(chǎn)生豐富的活性物質(zhì)包括抗菌劑［5-11］、抗腫瘤劑［12-13］、生防制劑［14-19］、生物催化劑［20］、磷脂酶抑制劑［21］和免疫抑制劑［22］，在醫(yī)藥和農(nóng)用抗生素的開(kāi)發(fā)上得到了廣泛的應(yīng)用。

近年來(lái)可培養(yǎng)及未培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝放線菌在植物根際、落葉堆、海泥等具有廣泛的分布［23］。Sembiring 等［3］從南洋楹（Paraserianthes falcataria）植物根際分離到大量紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝放線菌新物種。Sahin等［24］發(fā)現(xiàn)紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝放線菌在土耳其豆類植物根際具有多樣性的分布。Kang等［25］從三齒蒿（Artemisia tridentate）根際分離到的紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝放線菌菌株對(duì)植物病原真菌和白色念珠菌具有廣譜的抗性。我們前期的研究證實(shí)，紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝的放線菌菌株在海南藥用植物根際也有一定的分布［26］，并從藥用植物海南粗榧根際分離得到一株紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝的鏈霉菌30702，該菌株對(duì)山藥炭疽病菌、芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌等植物病原真菌都顯示出強(qiáng)烈的拮抗活性［27］。本研究對(duì)其種水平的分類地位和生防特性進(jìn)行深入研究，以期為該菌株在植物生防菌劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用上提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株30702，由本實(shí)驗(yàn)室前期從熱帶藥用植物粗榧根際土壤中分離得到。供試山藥炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）由本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉25 g，黃豆粉20 g，MgSO4.7H2O 0.6 g，CaCO30.2 g，水1 000mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 鏈霉菌30702的DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 參照周雙清等［28］方法進(jìn)行菌株DNA 的提取。選取16S rRNA 基因和5個(gè)看家基因atpD、gyrB、recA、rpoB和trpB為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。它們?cè)诜啪€菌的基礎(chǔ)代謝中行使不同的功能。其中atpD 基因編碼F0F1-ATP 合成酶β亞基；gyrB基因編碼DNA解旋酶β亞基；recA 基因編碼重組酶A；rpoB 基因編碼RNA 聚合酶β亞基；trpB基因編碼色氨酸合成酶β亞基。各基因序列PCR 擴(kuò)增的條件參照Guo等［29］的方法，目標(biāo)片段（TaKaRa試劑盒）回收、純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.2 鏈霉菌30702系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及MLSA多位點(diǎn)序列分析 將獲得的16S rRNA 基因序列登錄EzTaxon 數(shù)據(jù)庫(kù)中作blast 序列比對(duì)，同時(shí)下載相關(guān)相似菌株序列，用Mega6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。獲得的atpD、gyrB、recA、rpoB和trpB基因序列，參照Guo等［29］的方法，首尾相連拼接成多基因序列，并在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載相關(guān)菌株的5個(gè)看家基因序列拼接成多基因序列，采用Mega6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用Kimura 2-parameter（K2P）模型計(jì)算多位點(diǎn)序列進(jìn)化距離。

1.2.3 鏈霉菌30702形態(tài)及培養(yǎng)特征分析 培養(yǎng)特征描述所用培養(yǎng)基參照國(guó)際鏈霉菌規(guī)劃中的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基［30］。將供試菌株30702分別接種到ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7瓊脂培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)7-21 d，觀察并記錄放線菌菌落形態(tài)及培養(yǎng)特征。

1.2.4 鏈霉菌30702生理生化特征 溫度試驗(yàn)、pH試驗(yàn)、耐鹽度測(cè)定、脲酶試驗(yàn)、明膠液化、硝酸鹽還原、碳源利用實(shí)驗(yàn)和氮源利用實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［31］的方法進(jìn)行。

1.2.5 鏈霉菌30702細(xì)胞壁化學(xué)分析 供試菌株30702的細(xì)胞壁氨基酸和糖組分分析參照Lechevalier等［32］的方法。

1.2.6 鏈霉菌30702的產(chǎn)酶特性 供試菌株30702產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶等檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［33］。

1.2.7 鏈霉菌30702促生長(zhǎng)特性 供試菌株30702產(chǎn)鐵載體、解磷活性、產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶以及體外促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方法參照文獻(xiàn)［34］。其中體外促進(jìn)植物生長(zhǎng)試驗(yàn)具體如下：將菌株30702接種在MS 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，3 d后將擬南芥種子種植在MS培養(yǎng)基的另一端，距離菌株30702 5 cm，22℃，16 h光照，8 h黑暗交替培養(yǎng)7 d。以未接菌的MS 培養(yǎng)基為對(duì)照，電鏡觀察擬南芥幼苗的根及根毛。掃描電鏡照片由海南大學(xué)測(cè)試中心完成。

1.2.8 菌株30702發(fā)酵粗提物制備 將菌株30702接種發(fā)酵培養(yǎng)基中（200 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶），180 r/min，28℃恒溫培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液離心（4℃，4 000 r/min，10 min），除去上清，得到菌體。向菌體中加入50 mL丙酮。搖床上振蕩浸提2 h，離心收集上清液，旋蒸蒸發(fā)儀蒸干得發(fā)酵粗提物。

1.2.9 菌株30702發(fā)酵粗提物 抑制山藥炭疽菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng) 取10 μL山藥炭疽菌的孢子懸浮液（孢子濃度為107個(gè)/mL）與 20 μL的葡萄糖溶液（1g/L），以及一定量的發(fā)酵粗提物混合均勻，發(fā)酵粗提物終濃度分別設(shè)置為 0 μg/ mL，15 μg/ mL，25 μg/mL，50 μg/ mL，75 μg/ mL 和 100 μg/ mL，滴加在無(wú)菌的血球計(jì)數(shù)板上，放置在無(wú)菌的培養(yǎng)皿里。28℃保濕培養(yǎng)24 h，觀察孢子萌發(fā)和菌絲形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 菌株30702的菌種鑒定

2.1.1 菌株30702 的16S rRNA基因序列分析 PCR擴(kuò)增菌株30702的16S rRNA基因序列，獲得其序列全長(zhǎng)為1 481 bp。在EzTaxon 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)檢索，發(fā)現(xiàn)菌株30702與紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝的有效發(fā)表種的序列最相似，其中相似性前三位的菌株 為 Streptomyces solisilvae HNM0141T，Streptomyces malaysiensis NBRC 16446T和Streptomyces samsunensis M1463T，相似性分別為100%、99.4%和98.8%。選取相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，利用MEGA6.0 軟件采用N-J 法（重復(fù)度1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。結(jié)果表明菌株30702與S. solisilvae HNM0141T，S. malaysiensis NBRC 16446T和S. samsunensis M1463T聚在同一個(gè)大的分支上，說(shuō)明菌株30702與這3株菌的親緣關(guān)系較近，其中菌株30702與S. solisilvae HNM0141T又聚成一個(gè)小分支，表明S. solisilvae HNM0141T是菌株30702親緣關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株，因此選取這3株作為下述實(shí)驗(yàn)的參照菌株。

圖1 菌株30702的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.1.2 菌株30702 的MLSA分析 擴(kuò)增獲得菌株30702的5個(gè)看家基因atpD、gyrB、recA、rpoB和trpB基因序列，并首尾相連拼接成多基因序列與菌株S. solisilvae HNM0141，S. malaysiensis NBRC 16446和S. samsunensis M1463的多基因拼接序列等構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。菌株30702與鏈霉菌S.solisilvae HNM0141，S. malaysiensis NBRC 16446和S. samsunensis M1463同樣聚在一單獨(dú)的分支上，其中菌株30702與鏈霉菌S. solisilvae HNM0141又聚在同一個(gè)小分支上。遺傳進(jìn)化距離計(jì)算（表1）表明，菌株30702與鏈霉菌S. solisilvae HNM0141的多基因序列進(jìn)化距離為0.004，與其他兩株菌的多基因序列進(jìn)化距離均大于0.007（分別為0.118和0.112）。

圖2 菌株30702基于5個(gè)看家基因串聯(lián)的進(jìn)化樹(shù)

表1 菌株30702 與參照菌株的多基因序列進(jìn)化距離

2.1.3 形態(tài)及培養(yǎng)特征分析 菌株30702在ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7六種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，氣生菌絲為綜色、粉白色或灰色，基內(nèi)菌絲為深灰色、棕黃色、亮黃色和黃綠色；在所有培養(yǎng)基上不產(chǎn)生色素（表2）。菌株30702與S. solisilvae HNM0141在形態(tài)和培養(yǎng)特征上最相似，而與S.malaysiensis NBRC 16446和S. samsunensis M1463則存在一定差異。

2.1.4 生理生化特征 菌株30702與3株參照菌株均能利用供試的9種常見(jiàn)碳源（表3）；菌株30702能夠利用丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、甘氨酸和賴氨酸最為惟一氮源，不能利用酪氨酸、酪蛋白和組氨酸作為氮源（表4）。與參照菌株相比，菌株30702與S. solisilvae HNM0141在氮源利用能力上更相近，與其他兩株菌存在差異，如菌株30702能夠利用亮氨酸和苯丙氨酸，而S.malaysiensis NBRC 16446和S. samsunensis M1463不能，菌株30702能夠利用精氨酸和纈氨酸，而S.samsunensis M1463則不能。

菌株30702與所有參照菌株在明膠液化、脲酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性（表5），生長(zhǎng)溫度范圍均為20-40℃，生長(zhǎng)的酸度范圍均為pH5-10。菌株30702在鹽度為7%時(shí)仍能生長(zhǎng)，S. samsunensis M1463和S. solisilvae HNM0141在鹽度為5%時(shí)均能生長(zhǎng)，S. malaysiensis NBRC 16446在鹽度為4%時(shí)能生長(zhǎng)，在5%時(shí)不能生長(zhǎng)。這說(shuō)明菌株30702的耐鹽性更好。

2.1.5 細(xì)胞壁化學(xué)分析 菌株30702細(xì)胞壁氨基酸成分主要有甘氨酸和L-DAP；細(xì)胞壁糖類成分主要為半乳糖。表明菌株30702與鏈霉菌的細(xì)胞壁化學(xué)特征相符。

2.2 鏈霉菌30702的生物防治特性

菌株30702能夠產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶和ACC脫氨酶以及產(chǎn)生鐵載體，并且具有解磷的能力。同時(shí)，菌株30702能夠促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)，在MS培養(yǎng)基上表現(xiàn)為生長(zhǎng)茂盛，葉片厚而綠，根毛較長(zhǎng)且數(shù)目較多（圖3-B，3-b）。而對(duì)照組葉片薄而發(fā)黃，根毛數(shù)目少，根短，植物生長(zhǎng)弱（圖3-A，3-a）。

2.3 菌株30702發(fā)酵粗提物抑制炭疽菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)

菌株30702發(fā)酵粗提物對(duì)山藥炭疽菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)具有較好的抑制作用。在發(fā)酵粗提物濃度為15 μg/mL時(shí)，抑制率為（90.33±0.5）%；發(fā)酵粗提物濃度為25 μg/m時(shí)，抑制率為（90.53±0.8）%；發(fā)酵粗提物濃度為50 μg/m時(shí)，抑制率為（93.35±0.8）%；發(fā)酵粗提物濃度為75 μg/m時(shí)，抑制率為（96.82±0.9）%；發(fā)酵粗提物濃度為100 μg/m時(shí)，抑制率為（99.33±0.6）%。隨著濃度的增加，抑制效果越來(lái)越顯著。在濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，抑制率幾乎為100%（圖4）。

表2 菌株30702與參照菌株培養(yǎng)特征的比較

表3 菌株30702與參照菌株碳源利用試驗(yàn)

3 討論

鏈霉菌是一類具有重要應(yīng)用價(jià)值的生防放線菌資源，其分類地位的確認(rèn)是深入研究其生防功能的前提。16S rRNA基因序列分析是快速確認(rèn)放線菌分類地位最常用的方法之一［35］。但基因組內(nèi)的多拷貝性致使16S rRNA 基因不能很好的區(qū)分屬內(nèi)密切相關(guān)的物種，尤其是鏈霉菌屬同一clade中的種［36］。因此，一些分類學(xué)家推薦聯(lián)合使用多個(gè)看家基因串聯(lián)的多位點(diǎn)序列比較（MLSA）來(lái)鑒定鏈霉菌種的分類地位［36-37］。研究表明鏈霉菌MLSA的進(jìn)化距離與DNA-DNA雜交（DDH）之間表現(xiàn)出很強(qiáng)的數(shù)據(jù)相關(guān)性，70%的DDH值匹配性于0.007的MLSA距離［38］。本實(shí)驗(yàn)的前期研究中，采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法獲得了菌株30702的16S rRNA基因部分序列，通過(guò)序列比對(duì)分析將菌株30702初步鑒定為鏈霉菌屬紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝中的放線菌［27］，但其種水平的分類地位尚未確定。

表4 菌株30702與參照菌株氮源利用試驗(yàn)

表5 菌株30702與參照菌株其它生化試驗(yàn)

圖3 菌株30702體外促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)

圖4 菌株30702發(fā)酵粗提物對(duì)炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)化克隆測(cè)序的方法獲得了菌株30702的16S rRNA基因的全長(zhǎng)序列（1481 bp），通過(guò)序列比對(duì)和16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，確認(rèn) 了 Streptomyces solisilvae HNM0141T，Streptomyces malaysiensis NBRC 16446T和Streptomyces samsunensis M1463T為該菌株親緣關(guān)系相對(duì)較近的參照菌株。其中Streptomyces solisilvae HNM0141T與菌株30702的親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到100%，因此基本推斷菌株30702為Streptomyces solisilvae。為了驗(yàn)證這種推斷，本研究將菌株30702與參照菌株進(jìn)行了MLSA多位點(diǎn)序列分析。結(jié)果表明菌株30702與S.solisilvae HNM0141的MLSA進(jìn)化距離小于0.007（種的界限），與其他參照菌株的MLSA進(jìn)化距離均大于0.007。根據(jù)Rong和Huang［38］的觀點(diǎn)，菌株30702與S. solisilvae HNM0141理應(yīng)歸屬于同一個(gè)種，而區(qū)別于其他兩株參照菌。此外，形態(tài)及生理生化特征的比較結(jié)果也支持了這種結(jié)論。因此，菌株30702最終被鑒定為紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝中的Streptomyces solisilvae。

放線菌的生防特性國(guó)內(nèi)外已有一定的報(bào)道，主要包括產(chǎn)抗生素、鐵載體、水解酶（幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖苷酶、蛋白酶等）和誘導(dǎo)寄主抗病性等［39］。本研究的菌株30702的發(fā)酵粗提物能顯著抑制山藥炭疽菌孢子的萌發(fā)和孢子絲的生長(zhǎng)，表明該菌株產(chǎn)生了抗真菌作用的抗生素。同時(shí)，檢測(cè)到菌株30702產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和β-葡聚糖苷酶等水解酶，這些水解酶據(jù)報(bào)道都能瓦解絲狀病原真菌的細(xì)胞壁，從而抑制病菌的生長(zhǎng)發(fā)育［40］。其次，菌株30702還具有產(chǎn)生鐵載體的能力，可以通過(guò)捕獲鐵離子達(dá)到抑制植物病原菌生長(zhǎng)的目的［40］。此外，菌株30702還具有促植物生長(zhǎng)的特性，接種的擬南芥表現(xiàn)為根增長(zhǎng)，根毛數(shù)目增多，葉片厚而發(fā)綠，植株生長(zhǎng)茂盛。這可能與菌株30702具有解磷作用和產(chǎn)ACC脫氨酶有關(guān)，有報(bào)道表明生防細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生激素、ACC脫氨酶以及解磷作用等改善植物根的發(fā)育，達(dá)到促進(jìn)植物生長(zhǎng)的目的［41］。因此，上述研究結(jié)果綜合表明菌株30702具有優(yōu)良的生防特性，預(yù)示其在植物病害的生物防治上具有較好的潛在應(yīng)用前景。但其抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、發(fā)酵工藝、制劑研發(fā)、應(yīng)用方式等尚需進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室從海南粗榧根際分離到一株鏈霉菌30702，通過(guò)16S rRNA基因序列和多位點(diǎn)序列分析、并結(jié)合形態(tài)和生理生化特征比較分析，將鏈霉菌30702鑒定為紫黑鏈霉菌進(jìn)化分枝中的Streptomyces solisilvae。該菌株能夠產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶、ACC脫氨酶、鐵載體，具有解磷活性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性，發(fā)酵代謝產(chǎn)物能夠抑制山藥炭疽菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。

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