干旱對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)的影響

張珊珊，康洪梅，楊文忠*，諾蘇那瑪

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院 云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.賓夕法尼亞州立大學(xué) 理學(xué)院，美國(guó)賓夕法尼亞州 16563)

落種的萌發(fā)成苗過(guò)程是森林天然更新的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在不同生境中，水分因子嚴(yán)重影響種子和幼苗的命運(yùn)[1-4]。種子萌發(fā)作為植物生活史的初始階段，也最易受干旱脅迫的影響，進(jìn)而影響到植株后期生長(zhǎng)和發(fā)育[5-7]。聚乙二醇(PEG)常被用來(lái)模擬干旱脅迫[8]，研究干旱導(dǎo)致的水分缺失對(duì)植物種子萌發(fā)的作用[9-11]。結(jié)果表明，PEG會(huì)抑制很多植物的種子萌發(fā)，且隨著濃度的增加，抑制程度也隨之加劇[12-14]。

水分不僅為種子萌發(fā)提供必要的水壓需求，還通過(guò)其他作用方式影響其種子萌發(fā)，例如自毒作用[15-18]。自毒作用主要存在于一些雜草和作物，尤其是在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，具有濃度依賴性[19-21]。研究證實(shí)，種內(nèi)自毒作用也是影響針葉林天然更新成敗的關(guān)鍵因素，對(duì)其林分更新有一定的阻礙作用[22-26]。因此，干旱的發(fā)生可能會(huì)一方面導(dǎo)致植物種子萌發(fā)生理上的水分需求限制，另一方面致使依賴于濃度的自毒效應(yīng)加劇，從而阻礙森林的天然更新。盡管如此，目前將這兩者結(jié)合起來(lái)研究干旱對(duì)種子萌發(fā)影響的文獻(xiàn)卻甚少。

云南藍(lán)果樹(shù)(Nyssayunnanensis)，為藍(lán)果樹(shù)科(Nyssaceae)藍(lán)果樹(shù)屬(NyssaGronov)落葉大喬木，屬國(guó)級(jí)Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，云南特有種和極危種[27]。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南藍(lán)果樹(shù)天然林下有大量種子散落，但皆無(wú)云南藍(lán)果樹(shù)幼苗，天然更新困難[28]。前期研究表明，干旱脅迫對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)葉片的解剖結(jié)構(gòu)及其光合特征產(chǎn)生了顯著的抑制作用[29-30]，但是干旱脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響如何有待研究；另外，云南藍(lán)果樹(shù)的根、莖、葉和種皮浸提液中都存在具有抑制自身種子萌發(fā)的自毒物質(zhì)[31-32]，但這種自我抑制作用是否與濃度相關(guān)卻不得而知；而且，研究結(jié)果表明云南藍(lán)果樹(shù)的根、莖和葉的自毒效應(yīng)較強(qiáng)[14]，因此本研究選取根、莖和葉的浸提液進(jìn)行相關(guān)研究。

因此，為了回答干旱對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)的影響機(jī)制如何，及水分需求和自毒效應(yīng)對(duì)其種子萌發(fā)影響的貢獻(xiàn)率大小這兩個(gè)科學(xué)問(wèn)題，本研究采用雙因子室內(nèi)受控實(shí)驗(yàn)綜合研究了干旱導(dǎo)致的水分需求限制和自毒效應(yīng)加劇對(duì)種子萌發(fā)的影響。其中，干旱脅迫設(shè)置4個(gè)PEG濃度梯度(0、5%、10%和15% 4個(gè)水平)，自毒效應(yīng)包括自毒物質(zhì)的器官來(lái)源因子(根，莖和葉3個(gè)水平)和濃度梯度因子(25，12.5，6.25，3.125 g/L和對(duì)照5個(gè)水平)。研究結(jié)果能夠闡釋干旱對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)天然更新過(guò)程中種子萌發(fā)這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響機(jī)制，為解決野外天然更新困難的問(wèn)題提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而揭示其瀕危原因，促進(jìn)極小種群物種的有效保護(hù)與恢復(fù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的云南藍(lán)果樹(shù)種子采于云南省西雙版納州普文鎮(zhèn)普文試驗(yàn)林場(chǎng)天然林。果實(shí)采回后，去除肉質(zhì)外果皮，洗凈含有堅(jiān)硬內(nèi)果皮的種子，用水選法除去浮在水面的癟粒，自然陰干備用。

從野外自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的云南藍(lán)果樹(shù)自然種群植株周圍取樣，將其根、莖、葉分開(kāi)，用蒸餾水清洗干凈后用吸水紙吸干表面，65 ℃恒溫烘干，粉碎，待用。

聚乙二醇(PEG)作為一種高分子滲透劑，可以人為的限制水分利用速率，用來(lái)模擬不同程度的干旱脅迫。

1.2 試驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)為3 因子隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)，分別為干旱脅迫因子(0、5%、10%和15% 4個(gè)水平)、自毒物質(zhì)的器官來(lái)源因子(根、莖和葉3個(gè)水平)和濃度梯度因子(25，12.5，6.25，3.125 g/L和對(duì)照5個(gè)水平)，每個(gè)處理5次重復(fù)。共有4(水分梯度)×3(器官來(lái)源)×5(濃度梯度)×5次重復(fù)=300個(gè)培養(yǎng)皿。

干旱脅迫處理：挑選飽滿優(yōu)質(zhì)、大小基本一致的種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒10 min，清水洗凈后放入鋪有雙層濾紙的90 mm培養(yǎng)皿中，每皿30 粒。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)水平的處理，分別為5%、10%和15%的聚乙二醇溶液(PEG 6 000)及清水對(duì)照，對(duì)應(yīng)的土壤水勢(shì)分別為-0.58，-1.66，-3.25 MPa和-0.01 MPa。實(shí)驗(yàn)初期，每培養(yǎng)皿加入10 mL處理液，對(duì)照加入等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，根據(jù)種子吸脹情況，每天適當(dāng)加入其相同脅迫強(qiáng)度的處理液，每3 d更換培養(yǎng)皿。

浸提液處理：將根、莖和葉分別稱取5 g，加入100 mL蒸餾水中并用玻璃棒攪拌均勻，浸泡48 h后，用兩層紗布過(guò)濾，即制成干物質(zhì)含量為50 g/L的浸提液母液，并稀釋成等量的25，12.5，6.25和3.125 g/L的溶液備用。90 mm 培養(yǎng)皿中加10 mL浸提液，對(duì)照組(CK)加10 mL蒸餾水。定期加蒸餾水，以保證培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤(rùn)。

每皿播已表面消毒的云南藍(lán)果樹(shù)種子30粒，置于人工變溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度控制在25 ℃，每天光照12 h，2 000 lx，濕度70%。測(cè)定方法參見(jiàn)《種子檢驗(yàn)學(xué)》[32]。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

發(fā)芽率(GR):

GR=SN1/SN0×100%

(1)

式(1)中，SN1為供試種子的發(fā)芽粒數(shù)，SN0為供試種子的總粒數(shù)。

發(fā)芽勢(shì)(GP)：

GP=SNm/SN0×100%

(2)

式(2)中，SNm為發(fā)芽數(shù)量達(dá)到最高峰時(shí)種子發(fā)芽粒數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用多因素方差分析方法比較PEG 模擬的干旱脅迫、不同器官和不同濃度梯度的浸提液及其交互作用對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)的影響。方差分析時(shí)，不滿足方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)通過(guò)[arcsin]或[log(x+1)]轉(zhuǎn)換以滿足方差分析的要求。通常采用Post-hoc Tukey方法檢驗(yàn)變量的顯著性，如果數(shù)據(jù)不滿足參數(shù)檢驗(yàn)的條件，就采用Kruskall-Wallis方法檢驗(yàn)。5%為顯著水平，1%為極顯著水平。建立二元線性回歸模型Y=a+x1×b1+x2×b2，其中Y表示云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)(發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率)，a為常量，x1為浸提液濃度，b1為浸提液濃度的影響系數(shù)，x2為PEG 6 000濃度，b2為PEG 6 000濃度的影響系數(shù)。所有的數(shù)據(jù)都通過(guò)SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南藍(lán)果樹(shù)不同器官浸提液和PEG 6 000對(duì)其種子萌發(fā)的影響

PEG 6 000濃度、浸提液濃度和浸提液來(lái)源器官分別對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)產(chǎn)生極顯著的影響(表1，P<0.01)。但是只有PEG 6 000濃度和浸提液濃度之間交互作用的影響是極顯著的，而PEG 6 000濃度與浸提液來(lái)源器官之間、浸提液濃度與浸提液來(lái)源器官之間，及三者處理之間的交互作用對(duì)種子萌發(fā)的影響均沒(méi)有顯著性差異。

隨著云南藍(lán)果樹(shù)浸提液質(zhì)量濃度的升高，不管PEG 6 000濃度如何，云南藍(lán)果樹(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都呈遞減狀態(tài)，但是很多指標(biāo)在浸提液質(zhì)量濃度高于12.5 g/L時(shí)，降低幅度不顯著(表2、表3和表4)。在測(cè)定的所有指標(biāo)中，PEG 6 000處理的影響也不同(表2、表3和表4)。不管云南藍(lán)果樹(shù)浸提液質(zhì)量濃度如何，隨著PEG 6 000濃度的增加，測(cè)量指標(biāo)的值也逐漸減少，但是大部分指標(biāo)在10%濃度與15%濃度之間的差異不顯著。

表1 云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)的方差分析Tab.1 Significant level of effects of factors and factor interactions on variables based on two-way ANOVA

**：在0.01水平上差異顯著(雙側(cè)檢驗(yàn))；ns：在0.05水平上差異不顯著(雙側(cè)檢驗(yàn))
**:Difference is significant at the 0.001 level (2-tailed);ns:Difference is not significant at the 0.05 level (2-tailed)

表2 云南藍(lán)果樹(shù)根浸提液和PEG 6 000對(duì)其種子萌發(fā)的影響Tab.2 Effects of root extracts and different PEG 6 000 concentrations on seed germination of Nyssa yunnanensis

大寫字母表示不同PEG 6 000濃度之間的差異；小寫字母表示不同根浸提液質(zhì)量濃度之間的差異
Different capital letters meant significant differences between different PEG 6 000 concentrations at 0.05 level;different lowercase letters in the same column meant significant differences between different extracts concentrations at 0.05 level

表3 云南藍(lán)果樹(shù)莖提液和干旱脅迫對(duì)其種子萌發(fā)的影響Tab.3 Effects of stem extracts and different PEG 6 000 concentrations on seed germination of Nyssa yunnanensis

大寫字母表示不同PEG 6 000濃度之間的差異；小寫字母表示不同根浸提液質(zhì)量濃度之間的差異
Different capital letters meant significant differences between different PEG 6 000 concentrations at 0.05 level;different lowercase letters in the same column meant significant differences between different extracts concentrations at 0.05 level

表4 云南藍(lán)果樹(shù)葉浸提液和PEG6000對(duì)其種子萌發(fā)的影響Tab.4 Effects of leaf extracts and different PEG 6 000 concentrations on seed germination of Nyssa yunnanensis

大寫字母表示不同PEG 6 000濃度之間的差異；小寫字母表示不同根浸提液質(zhì)量濃度之間的差異
Different capital letters meant significant differences between different PEG 6 000 concentrations at 0.05 level;different lowercase letters in the same column meant significant differences between different extracts concentrations at 0.05 level

2.2 二元線性回歸模型的建立

基于表2、表3和表4的數(shù)據(jù)，分別選取發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率作為因變量，浸提液濃度和PEG 6 000濃度作為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析。從表5、表6和表7可知，不管是云南藍(lán)果樹(shù)根浸提液還是葉浸提液處理，建立的所有回歸模型的回歸效果極為顯著，證明模型是可用的。而且，回歸模型的各項(xiàng)回歸系數(shù)，及對(duì)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)都表明，各項(xiàng)系數(shù)都是極為顯著的。建立的方程結(jié)果表明，因變量(包括發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率)與自變量(浸提液濃度和PEG 6 000濃度)的標(biāo)準(zhǔn)化影響系數(shù)之間都是負(fù)相關(guān)關(guān)系。云南藍(lán)果樹(shù)不同器官浸提液濃度的標(biāo)準(zhǔn)化影響系數(shù)的絕對(duì)值都低于PEG 6 000濃度的標(biāo)準(zhǔn)化影響系數(shù)的絕對(duì)值。

表5 基于云南藍(lán)果樹(shù)根浸提液和PEG 6 000建立的二元回歸分析模型Tab.5 Established two dimensional regression analysis model based on Nyssa yunnanensis root extracts and PEG 6 000

表6 基于云南藍(lán)果樹(shù)莖浸提液和PEG 6 000建立的二元回歸分析模型Tab.6 Established two dimensional regression analysis model based on Nyssa yunnanensis stem extracts and PEG 6 000

表7 基于云南藍(lán)果樹(shù)葉浸提液和PEG 6 000建立的二元回歸分析模型Tab.7 Established two dimensional regression analysis model based on Nyssa yunnanensis leaf extracts and PEG 6 000

3 結(jié)論與討論

干旱是影響森林天然更新過(guò)程中種子萌發(fā)的重要生態(tài)因子之一[34-35]。對(duì)許多植物來(lái)說(shuō)，種子萌發(fā)階段對(duì)環(huán)境脅迫高度敏感[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG 6 000模擬的干旱脅迫對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)有顯著的抑制作用，且隨著PEG 6 000濃度的增加，云南藍(lán)果樹(shù)種子的萌發(fā)率和發(fā)芽勢(shì)都呈下降趨勢(shì)。但是，萌發(fā)率和發(fā)芽勢(shì)剛開(kāi)始會(huì)隨著PEG 6 000濃度的增加而顯著降低(PEG 6 000濃度為0%～10%)，在PEG 6 000濃度分別為10%和15%時(shí)，雖都顯著低于對(duì)照組，但是在兩濃度之間的差異卻不顯著。這與之前關(guān)于中輕度干旱脅迫會(huì)促進(jìn)種子萌發(fā)的結(jié)論[37-42]是相反的，意味著云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)階段對(duì)干旱脅迫的耐受性較弱。

一般說(shuō)到干旱脅迫，大多只會(huì)想到水分缺失對(duì)植物的各種影響，然而，與水分密切相關(guān)的自毒作用也會(huì)抑制天然更新過(guò)程中種子萌發(fā)這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9,43-44]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，云南藍(lán)果樹(shù)根、莖和葉的浸提液不僅會(huì)對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)產(chǎn)生極顯著的影響，且隨著云南藍(lán)果樹(shù)浸提液質(zhì)量濃度的升高，云南藍(lán)果樹(shù)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都呈遞減狀態(tài)，即自毒作用可能是抑制云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)的又一重要因素。另外，PEG 6 000濃度和浸提液濃度之間交互作用的影響也是極顯著的，說(shuō)明干旱脅迫是通過(guò)對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)的水分需求和自毒效應(yīng)兩者的共同作用，進(jìn)而影響種子萌發(fā)，阻礙其天然更新。由此可見(jiàn)，水分對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)的影響方式不是單一的，而是通過(guò)多種方式協(xié)同作用。

那么，PEG導(dǎo)致的干旱脅迫和自毒效應(yīng)這兩個(gè)影響云南藍(lán)果樹(shù)天然更新的因子，哪個(gè)貢獻(xiàn)率更高呢？根據(jù)二元線性回歸分析結(jié)果表明，因變量(包括發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率)與自變量(浸提液濃度和PEG 6 000濃度)的標(biāo)準(zhǔn)化影響系數(shù)之間都是負(fù)相關(guān)關(guān)系。而且，在云南藍(lán)果樹(shù)三種(根、莖和葉)浸提液處理情況下，浸提液濃度的標(biāo)準(zhǔn)化影響系數(shù)的絕對(duì)值都低于PEG 6 000濃度的標(biāo)準(zhǔn)化影響系數(shù)的絕對(duì)值，說(shuō)明PEG導(dǎo)致的水分缺失對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)的影響要強(qiáng)于干旱導(dǎo)致的自毒效應(yīng)加劇的影響。

據(jù)報(bào)道，導(dǎo)致很多地區(qū)森林更新失敗的干旱是由氣候變化引起的[45-47]。根據(jù)普文林場(chǎng)過(guò)去55年的氣象記錄，云南自然分布區(qū)的氣候發(fā)生了巨大的變化[48]。從1960年到2014年，該地區(qū)的年平均降水量和相對(duì)濕度分別下降了21.7%和6.3%[49]。因此，氣候變化導(dǎo)致的干旱可能是造成云南藍(lán)果樹(shù)天然更新困難的主要原因，進(jìn)而導(dǎo)致了該物種種群數(shù)量的減少。除了全球氣候趨勢(shì)的變化，云南藍(lán)果樹(shù)天然生境的小氣候也受到了當(dāng)?shù)厣a(chǎn)活動(dòng)的影響，例如原生境內(nèi)的大量天然林不斷被橡膠、咖啡、茶葉等經(jīng)濟(jì)林所取代，旁邊的溪流逐漸干涸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的水分需求。因此，云南藍(lán)果樹(shù)天然更新困難的根本原因可能源于原始棲息地以及小氣候破壞導(dǎo)致的干旱脅迫。

綜合分析表明，氣候變化引起的干旱脅迫通過(guò)水分缺失和自毒效應(yīng)加劇兩種作用方式，共同影響了云南藍(lán)果樹(shù)天然更新過(guò)程中的種子萌發(fā)，嚴(yán)重影響了此種群的存活和生長(zhǎng)，加劇了云南藍(lán)果樹(shù)這一極小種群的惡化。相較于自毒效應(yīng)而言，干旱脅迫導(dǎo)致的水分缺失可能是導(dǎo)致云南藍(lán)果樹(shù)天然更新困難更重要的因素。因此，本試驗(yàn)基本解決了前面提出的科學(xué)問(wèn)題，闡明了干旱對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)的影響機(jī)制，初步揭示了云南藍(lán)果樹(shù)瀕危的原因和機(jī)理，為云南藍(lán)果樹(shù)的有效保護(hù)提供了科學(xué)理論依據(jù)，可促進(jìn)全國(guó)極小種群野生植物的保護(hù)與恢復(fù)。

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