電噴霧離子遷移譜快速檢測(cè)次烏頭堿的研究

孔景臨 劉衛(wèi)衛(wèi) 秦墨林 李寶強(qiáng) 丁俊杰 陳創(chuàng) 李海洋

1.防化研究院，北京 102205；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連 116023

離子遷移譜（Ion Mobility Spectrometry，IMS）技術(shù)是20世紀(jì)中期發(fā)展起來(lái)的一種微量化學(xué)分析技術(shù)，其分析原理是依據(jù)電場(chǎng)中離子因質(zhì)量、形狀、帶電荷情況的不同導(dǎo)致漂移時(shí)間的差異實(shí)現(xiàn)離子分離和測(cè)定。該技術(shù)與質(zhì)譜有相似之處，但不需要真空系統(tǒng)，也被稱(chēng)為常壓質(zhì)譜。與質(zhì)譜相比，IMS易于實(shí)現(xiàn)、設(shè)備簡(jiǎn)單、造價(jià)低廉，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，已成為美軍、北約部隊(duì)的點(diǎn)源檢測(cè)裝備以及歐美國(guó)家反恐應(yīng)急準(zhǔn)備的首選器材[1-2]。但外軍現(xiàn)有離子遷移譜檢測(cè)裝備主要采用63Ni，244Am等放射性電離源或是以電弧放電方式，使氣體樣品離子化，這類(lèi)電離源不能用于非揮發(fā)性化合物以及生物樣品的分析，檢測(cè)范圍受限，并且因存在放射源，使用及報(bào)廢存在隱患。20世紀(jì)90年代，電噴霧電離（Electrospray Ionization，ESI）被用于溶液中蛋白質(zhì)研究，液體樣品也可以通過(guò)ESI引入漂移管，通過(guò)離子遷移譜的方式進(jìn)行分析[3-5]。目前，電噴霧離子遷移譜（Electrospray Ionization-Ion Mobility Spectrometry，ESIIMS）已經(jīng)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用（ESI-IMS-MS）發(fā)展成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的先進(jìn)手段，在多肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方面發(fā)揮著重要作用[6-7]。

ESI-IMS大大拓寬了傳統(tǒng)IMS技術(shù)檢測(cè)對(duì)象范圍，為非揮發(fā)性、液體以及生物樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了新途徑，而這類(lèi)樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求量很大，特別是在天然產(chǎn)物化學(xué)、制藥、食品和藥品安全監(jiān)管、司法物證鑒定等領(lǐng)域?，F(xiàn)有的高效液相色譜法（HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）等均需使用大型實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，不僅運(yùn)轉(zhuǎn)成本高，也無(wú)法用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。2012年美國(guó)Excellism公司推出可車(chē)載ESI-IMS儀，但價(jià)格不菲[8]。本項(xiàng)目組在前期研究中自行搭建了電噴霧離子遷移譜儀，較為系統(tǒng)地研究了影響離子遷移譜譜圖質(zhì)量的主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括尾吹氣流速、電噴霧溶液組成、電噴霧溶液流速等，建立了基本的實(shí)驗(yàn)方法[9]。并在前期研究的基礎(chǔ)上，利用自制平臺(tái)，開(kāi)展了對(duì)非揮發(fā)性樣品的檢測(cè)研究。我們以烏頭類(lèi)中藥中常見(jiàn)的劇毒成分次烏頭堿（Hypaconitine）作為檢測(cè)對(duì)象，驗(yàn)證了自制平臺(tái)的效果。這類(lèi)藥材常有因不當(dāng)治療、誤食、蓄意投毒等導(dǎo)致的中毒的案例報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，離子門(mén)脈沖寬度對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響較大，通過(guò)參數(shù)優(yōu)化，自制平臺(tái)對(duì)次烏頭堿的檢測(cè)靈敏度可達(dá)800ng/mL。從進(jìn)樣到檢測(cè)次烏頭堿的信號(hào)在1min之內(nèi)即可完成，效率明顯高于HPLC。

紙噴霧（Paperspray）作為一種敞開(kāi)式常壓電離方式因其具有免除樣品前處理、可直接分析等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前快速檢測(cè)的研究熱點(diǎn)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)還著眼于現(xiàn)場(chǎng)使用的方便性，將紙噴霧這種敞開(kāi)式常壓電離方式與漂移管結(jié)合起來(lái)，形成紙噴霧離子遷移譜（paper spray ionization-ion mobility spectrometer，PSI-IMS）平臺(tái)，用紙噴霧替代噴霧針也實(shí)現(xiàn)了對(duì)次烏頭堿的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置、條件和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及條件 實(shí)驗(yàn)室搭建的ESI-IMS裝置如圖1所示，主要包括電噴霧電離源區(qū)、去溶劑化腔體、Bradbury-Neilsen離子門(mén)（BNG）、離子遷移區(qū)以及法拉第盤(pán)檢測(cè)器，去溶劑化腔體的內(nèi)徑為14 mm，離子遷移區(qū)的內(nèi)徑為25 mm。ESI離子源的噴霧針為液相色譜進(jìn)樣針（AGE，W-107，100 μL），電噴霧時(shí)高壓直接施加進(jìn)樣針上，噴霧針的針尖和對(duì)電極之間保持軸向距離10 mm，遷移區(qū)長(zhǎng)度為88 mm。紙噴霧離子遷移譜實(shí)驗(yàn)裝置與之類(lèi)似，如圖2所示，實(shí)驗(yàn)中將濾紙剪成三角形，用通電的鑷子夾持，濾紙尖端對(duì)準(zhǔn)去溶劑化區(qū)（圖3）即可實(shí)現(xiàn)噴霧針功能。

圖1 ESI-IMS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)實(shí)物圖

圖2 PSI-IMS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)實(shí)物圖

圖3 PSI電離裝置局部放大圖

1.1.2 試劑 次烏頭堿購(gòu)自百靈威（純度398%），甲醇、甲酸（Fluka試劑），準(zhǔn)確稱(chēng)量次烏頭堿，用甲醇溶解配成一定濃度的溶液，采用逐級(jí)稀釋的方法配制各種濃度的稀溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為：離子遷移管內(nèi)氣壓為環(huán)境氣壓，離子遷移管使用Bradbury-Nielsen型離子門(mén)，離子門(mén)脈沖寬度可調(diào)，離子門(mén)關(guān)門(mén)電壓控制為150 V。遷移管工作溫度為室溫25℃，漂氣為空氣，流速可調(diào)，遷移區(qū)電場(chǎng)強(qiáng)度為368.75 V/cm，電噴霧電壓3000 V。離子遷移譜圖的掃描時(shí)間為40 ms，平均次數(shù)為16次，單次檢測(cè)時(shí)間小于1 s。以正離子模式檢測(cè)次烏頭堿。以噴霧針與紙噴霧檢測(cè)次烏頭堿的差別主要在于上樣方式的不同，前者使用步進(jìn)電機(jī)以2 ml/min的流速推出待測(cè)液，而紙噴霧檢測(cè)時(shí)將樣品直接滴加在濾紙上。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 噴霧針?lè)绞綑z測(cè)次烏頭堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 參數(shù)優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)使用的樣品為次烏頭堿（hypaconitine，CAS號(hào)6900-87-4），其結(jié)構(gòu)式如圖4所示，分子式C33H45NO10，分子量615.71，白色柱狀結(jié)晶。對(duì)小鼠的急性毒性LD50（經(jīng)口）為5.8 mg/kg，毒性分級(jí)為劇毒?？紤]到次烏頭堿分子結(jié)構(gòu)中的氨基易于質(zhì)子化，因此采用正離子模式進(jìn)行離子遷移譜實(shí)驗(yàn)。著眼于現(xiàn)場(chǎng)使用的需要，以空氣為漂氣。圖5為室溫條件下，檢測(cè)1.1 mg/mL次烏頭堿所獲得的信號(hào)譜圖。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)離子門(mén)脈沖寬度小于200 μs時(shí)，基本上觀察不到次烏頭堿信號(hào)峰；當(dāng)增加離子門(mén)的脈沖寬度到200 μs 才能觀察到微弱的次烏頭堿信號(hào)峰（對(duì)應(yīng)圖5中譜線(xiàn)1）；進(jìn)一步增加離子門(mén)脈沖寬度到300 μs時(shí)，可以觀察到明顯的次烏頭堿信號(hào)峰（對(duì)應(yīng)圖5中譜線(xiàn)2）。分析這一現(xiàn)象，可以判斷譜峰信號(hào)強(qiáng)弱與Bradbury-Neilsen離子門(mén)（BNG）本身的清空效應(yīng)有關(guān)。次烏頭堿分子量較大，約化遷移率較小，通過(guò)BNG的時(shí)間較長(zhǎng)，需要較長(zhǎng)的離子門(mén)開(kāi)門(mén)脈沖才能夠通過(guò)BNG。這一結(jié)果指導(dǎo)了實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)定。另外，改變電噴液的pH值，添加甲酸，使其濃度達(dá)到0.1%，使用該弱酸性電噴液并不能提高次烏頭堿的檢測(cè)靈敏度。這是因?yàn)檎x子模式下，噴霧針尖端處發(fā)生氧化反應(yīng)[11]，電噴液中的甲醇被氧化脫氫，氫則與次烏頭堿氨基氮的孤對(duì)電子結(jié)合使次烏頭堿質(zhì)子化，體系中甲醇占絕大部分，這為陽(yáng)離子的形成提供了足夠的質(zhì)子來(lái)源，因此，加入甲酸起不到明顯作用。

圖4 次烏頭堿的分子結(jié)構(gòu)

圖5 不同離子門(mén)脈沖寬度下次烏頭堿的離子遷移譜圖

2.1.2 次烏頭堿的離子遷移譜圖分析 圖6是在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定的不同濃度次烏頭堿溶液的離子遷移譜圖。其中譜線(xiàn)1是不含次烏頭堿的空白對(duì)照，為甲醇溶劑譜線(xiàn)。依次往上的譜線(xiàn)2、3、4、5、6分別是800ng/mL，4mg/mL，8mg/mL，40mg/mL，80mg/mL的次烏頭堿溶液的離子遷移譜圖。由圖可見(jiàn)20.8ms處有一明顯信號(hào)，在正離子檢測(cè)模式下，該譜峰對(duì)應(yīng)的是質(zhì)子化的次烏頭堿。由約化遷移率的公式[2]，計(jì)算次烏頭堿的約化遷移率。式中L為遷移區(qū)長(zhǎng)度（cm）、td為離子漂移時(shí)間（s）、P，T分別為實(shí)驗(yàn)條件下的壓力（mmHg）及溫度（K），

將平臺(tái)及實(shí)驗(yàn)中的參數(shù)及漂移時(shí)間代入后，算出次烏頭堿的約化遷移率為1.23 cm2V-1s-1。

圖6 不同濃度次烏頭堿在ESI-IMS中的響應(yīng)譜圖

對(duì)比圖6中一系列譜線(xiàn)，可以看到次烏頭堿離子峰的信號(hào)強(qiáng)度與溶液濃度存在正相關(guān)。在此基礎(chǔ)上對(duì)平臺(tái)的檢測(cè)次烏頭堿的靈敏度和動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍進(jìn)行了分析。圖7為次烏頭堿離子峰面積隨濃度變化的動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲線(xiàn)。由圖7可見(jiàn)溶液濃度與信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)指數(shù)變化趨勢(shì)，在次烏頭堿溶液濃度較高時(shí)，響應(yīng)信號(hào)逐漸趨于平臺(tái)狀，這可能與一定脈沖間隔內(nèi)，進(jìn)入離子門(mén)內(nèi)離子數(shù)目達(dá)到飽和有關(guān)。圖8是該平臺(tái)對(duì)次烏頭堿檢測(cè)限的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中譜線(xiàn)1為空白對(duì)照，譜線(xiàn)2為濃度為800ng/mL的次烏頭堿溶液的檢測(cè)信號(hào)。其離子峰的信號(hào)強(qiáng)度和基線(xiàn)噪聲達(dá)到S/N=3的水平，該濃度可以定義為平臺(tái)對(duì)次烏頭堿的實(shí)際檢出限（LOD）。由此可以計(jì)算出用此自制平臺(tái)，對(duì)次烏頭堿的檢測(cè)靈敏度為 1.3′10-6mol/L。

圖7 次烏頭堿在ESI-IMS中的動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲線(xiàn)

圖8 次烏頭堿在ESI-IMS中的檢測(cè)靈敏度

2.2 紙噴霧檢測(cè)次烏頭堿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

濾紙剪成近似的等腰三角形，尖角約30°，先將溶劑滴在濾紙上，在三角形的濾紙的底邊施加高電壓，在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下，溶劑向?yàn)V紙的尖端遷移并在尖端放電，形成噴霧流，檢測(cè)到圖9所示的溶劑背景信號(hào)。再將100 mg/mL的次烏頭堿溶液滴在紙片上，譜圖上如圖10所示。圖中除出現(xiàn)溶劑峰簇外，在漂移時(shí)間為21.2 ms處出現(xiàn)次烏頭堿的信號(hào)峰，這與噴霧針電離方式檢測(cè)的次烏頭堿的漂移時(shí)間基本一致。紙噴霧電離的原理與噴霧針離子化相同，實(shí)際上噴霧針的變形，但紙噴霧電離不需要其他氣體協(xié)助去溶劑化，還具有噴霧針?biāo)痪邆涞姆蛛x優(yōu)點(diǎn)。

圖9 紙噴霧離子遷移譜檢測(cè)的溶劑背景信號(hào)

圖10 次烏頭堿經(jīng)紙噴霧電離后的離子遷移譜

3 討論

離子化源作為離子遷移譜儀器的一個(gè)重要組成部分，起著將待測(cè)樣品離子化的作用，其性能在一定程度上決定了IMS可以檢測(cè)化合物的范圍、靈敏度以及線(xiàn)性范圍等指標(biāo)。在IMS儀器中，特別是商品化的IMS儀器中，使用最廣泛的離子化源為放射性電離源。這種離子化源檢測(cè)的樣品主要是氣體或者具有揮發(fā)性的樣品，對(duì)于半揮發(fā)性和難揮發(fā)的樣品則需要特殊的熱解析進(jìn)樣器來(lái)輔助進(jìn)樣，限制了IMS在熱不穩(wěn)定性樣品和生物樣品分析中的應(yīng)用。ESI用作離子遷移譜的電離源，可以將液體樣品中的分析物或固體樣品溶解后直接轉(zhuǎn)化為氣相離子，大大拓寬IMS的檢測(cè)范圍。與HPLC等實(shí)驗(yàn)室儀器相比，ESI-IMS不僅造價(jià)低廉，還具有不需要使用各類(lèi)色譜純?nèi)軇恍枰牟?，?jīng)濟(jì)性好、保障要求低等優(yōu)點(diǎn)。此外，ESI-IMS易于小型化，在環(huán)境污染物、保健品藥品違法添加、爆炸物以及生物樣品的現(xiàn)場(chǎng)分析中展現(xiàn)了良好的前景。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘邪l(fā)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)毒害物質(zhì)的電噴霧離子遷移譜國(guó)產(chǎn)設(shè)備，為現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法、應(yīng)急響應(yīng)和應(yīng)急救援提供手段。本實(shí)驗(yàn)在自制平臺(tái)的基礎(chǔ)上，以次烏頭堿為檢測(cè)對(duì)象，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)其較高靈敏度和快速檢測(cè)。而傳統(tǒng)的離子遷移譜儀是無(wú)法對(duì)次烏頭堿這類(lèi)非揮發(fā)性、分子量較大的生物堿類(lèi)化合物進(jìn)行的檢測(cè)的。本實(shí)驗(yàn)使用紙噴霧電離替代噴霧針，也實(shí)現(xiàn)了對(duì)次烏頭堿的檢測(cè)。在現(xiàn)場(chǎng)使用條件下，紙噴霧比噴霧針更為方便，并且前者還具有噴霧針不具備的分離功能。紙噴霧電離局限性包括背景復(fù)雜的生物樣品會(huì)影響定量分析、纖維素的自由羥基會(huì)影響極性化合物的洗脫等。下一步工作將在此平臺(tái)基礎(chǔ)上，優(yōu)化紙噴霧的實(shí)驗(yàn)條件，提高紙噴霧的檢測(cè)靈敏度，建立電噴霧離子遷移譜針對(duì)生物堿、多肽等不同類(lèi)型毒害物質(zhì)的檢測(cè)方法，開(kāi)發(fā)非揮發(fā)性、高分子量有毒化合物的離子遷移譜數(shù)據(jù)庫(kù)，為這一自制平臺(tái)發(fā)展成實(shí)用設(shè)備提供軟件支持。

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