Atg3和Beclin1表達(dá)在乳腺癌新輔助化療療效預(yù)測中的價值

劉永波 陳奕至 郭怡輝 呂淑貞 穆穎 李艷萍

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院乳腺外科，北京 100038；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院病理科，北京 100038

新輔助化療可使80%以上的乳腺癌患者原發(fā)腫瘤縮小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)減少，從而降低腫瘤分期、為根治性手術(shù)創(chuàng)造條件，但也有20%的患者無法自新輔助化療獲益[1]。因此，早期預(yù)測患者新輔助化療療效，對于及時開展外科治療、避免貽誤手術(shù)時機(jī)有著重要意義，也是控制病情進(jìn)展、改善患者預(yù)后質(zhì)量的關(guān)鍵之一，但當(dāng)前臨床尚缺乏預(yù)測乳腺癌患者新輔助化療療效的客觀指標(biāo)[2]。近年來，有學(xué)者觀察到自噬相關(guān)基因Atg3、Beclin1對肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤預(yù)后的影響，且已有研究印證了上述基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的重要作用[3-4]。以此為基礎(chǔ)，擬觀察Atg3、Beclin1預(yù)測乳腺癌新輔助化療療效的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

自我院2014年5月至2017年3月經(jīng)病理組織學(xué)檢查明確Ⅲ期乳腺癌診斷[5]的女性患者中選取145例，患者均符合新輔助化療適應(yīng)證且病灶具有可測量性，排除已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者、入組前有抗腫瘤治療史者、合并其他惡性腫瘤者以及合并心、肝、腎等臟器嚴(yán)重功能不全者?；颊吣挲g33～74歲，平均（56.17±11.89）歲，發(fā)病位置：左側(cè)76例，右側(cè)69例；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌131例，浸潤性小葉癌6例，腺鱗癌3例，炎性乳腺癌3例，粘液癌2例。此次研究已征得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意并簽署書面協(xié)議。

1.2 治療方案

患者均接受ET新輔助化療方案治療[6]：多西他賽（賽諾菲制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20140039，規(guī)格0.5 mL:20 mg）75 mg/m2靜脈滴注（持續(xù)3 h），d1；表柔比星（輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20000496，規(guī)格10 mg）90 mg/m2靜脈滴注，d2。3周為1周期，患者新輔助化療均持續(xù)4周期，4周期后參照實(shí)體瘤療效反應(yīng)評價新標(biāo)準(zhǔn)（RECIST v1.1）評價其臨床療效[7]：完全緩解（CR）：所有目標(biāo)病灶消失，任何病理性淋巴結(jié)的短軸值均＜10 mm；部分緩解（PR）：以臨界半徑的總和為參照，所有目標(biāo)半徑的總和減小≥30%；疾病進(jìn)展（PD）：以目標(biāo)病灶半徑最小值為參照，所有目標(biāo)病灶半徑的綜合增加≥20%且半徑總和增加≥5 mm，或出現(xiàn)新的病灶；疾病穩(wěn)定（SD）：介于PR、PD之間。以CR＋PR為有效，SD＋PD為無效。

1.3 分析方法

于患者新輔助化療前取其粗針穿刺活檢病灶標(biāo)本，使用實(shí)時熒光定量PCR法檢測Atg3、Beclin1 mRNA表達(dá)情況，使用免疫組化法檢測Atg3、Beclin1染色情況，檢測方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[8-9]：實(shí)時熒光定量PCR法：以2-△△Ct法計算相對表達(dá)比例；免疫組化法：根據(jù)5個400×隨機(jī)視野內(nèi)Atg3、Beclin1染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例判定結(jié)果，染色強(qiáng)度不著色、淡黃色、棕黃色、黃褐色分別計0分、1分、2分、3分，陽性細(xì)胞（胞質(zhì)黃色-棕褐色顆粒）＜5、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～＜75%、≥75%分別計0分、1分、2分、3分、4分。染色強(qiáng)度積分及陽性細(xì)胞積分乘積為總分，總分0分、1～4分、5～8分、9～12分分別為陰性（-）、弱陽性（+）、中陽性（++）、強(qiáng)陽性（+++），-為不表達(dá)，+為低表達(dá)，++、+++為高表達(dá)。根據(jù)化療4周期后療效，將患者分別納入有效組、無效組，使用SPSS 19.0軟件分析，采用χ2檢驗或t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。比較兩組患者Atg3、Beclin1表達(dá)情況，總結(jié)Atg3、Beclin1對乳腺癌新輔助化療療效的預(yù)測價值。

2 結(jié)果

145例患者均完成4周期新輔助化療，化療結(jié)束后，CR 37例，PR 55例，SD 41例，PD 12例，總有效率為63.45%（92/145）。

新輔助化療有效組Atg3、Beclin1基因mRNA相對表達(dá)比例均高于無效組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 有效組與無效組患者Atg3、Beclin1基因mRNA相對表達(dá)比例比較（%，x±s）

新輔助化療有效組癌細(xì)胞內(nèi)Atg3、Beclin1免疫組化染色高表達(dá)率分別為88.04%、82.61%，均高于無效組的7.55%、3.77%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 有效組與無效組患者免疫組化染色結(jié)果比較（n/%）

3 討論

新輔助化療目的是對有局部治療機(jī)會的患者行前期化療，從而為后期手術(shù)治療或局部放射治療創(chuàng)造條件[10]。本研究145例乳腺癌患者均接受ET方案新輔助化療，其臨床總有效率為63.45%，說明多數(shù)乳腺癌患者可自新輔助化療中獲益。對新輔助化療藥物不敏感與患者基因表達(dá)差異有關(guān)，而自噬相關(guān)基因被認(rèn)為可對新輔助化療療效造成明顯影響[11]。自噬相關(guān)基因主要主導(dǎo)細(xì)胞自噬現(xiàn)象，細(xì)胞自噬是真核生物為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)分子、蛋白的重要生理過程，大量研究顯示，在腫瘤發(fā)生早期，自噬可通過腫瘤細(xì)胞內(nèi)因增殖作用，產(chǎn)生大量細(xì)胞器、蛋白，從而維持細(xì)胞正常生長與基因的穩(wěn)定性，并抑制腫瘤生長；而腫瘤細(xì)胞自身自噬作用可用于維持自身穩(wěn)態(tài)，并通過靶向自噬過程對抗化療藥物的毒性作用[12-13]。

Atg3位于人3號染色體上，在調(diào)控自噬體形成的過程中發(fā)揮著重要作用。一方面，Atg3可通過編碼蛋白作用，作為E2酶參與自噬催化過程，參與自噬體形成；另一方面，Atg3可維持線粒體穩(wěn)態(tài)，確保細(xì)胞整體穩(wěn)定性[14]。作為新輔助化療方案中的重要組成部分，多西他賽可抑制微管蛋白功能，干擾Atg3引導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗腫瘤效果[15]。在本次研究中，有效組患者化療前病灶組織Atg3 mRNA高表達(dá)，說明該組患者可能對化療藥物更為敏感，因此，可以認(rèn)為，新輔助化療能夠通過靶向調(diào)控Atg3表達(dá)，下調(diào)腫瘤細(xì)胞自噬活性，顯現(xiàn)治療效果。

Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30同源基因BECN1的標(biāo)記蛋白，主要參與自噬體產(chǎn)生與成熟過程，也是近年來新發(fā)現(xiàn)的重要自噬相關(guān)蛋白之一[16]。作為自噬過程啟動的關(guān)鍵蛋白，Beclin1可與Ⅲ型PI3K形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)Atg蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，從而促進(jìn)自噬體的形成[17]。同時，基礎(chǔ)研究顯示，自噬活化可促使乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥產(chǎn)生，而表柔比星類化療藥物可阻止mRNA形成過程并抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，從而拮抗Beclin1介導(dǎo)的細(xì)胞惡性行為，增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[18]。因此，高水平Beclin1表達(dá)者往往對化療更為敏感。

因此，可以認(rèn)為，Atg3和Beclin1表達(dá)能夠用于乳腺癌新輔助化療療效預(yù)測，化療前病灶組織較高的Atg3和Beclin1表達(dá)量往往意味著更為理想的治療效果，而Atg3和Beclin1低表達(dá)或不表達(dá)可能是導(dǎo)致患者化療敏感性不佳的主要原因。此次研究的局限性在于未對患者治療后病灶組織Atg3、Beclin1表達(dá)進(jìn)行再次檢測，在今后的研究中，補(bǔ)充這一環(huán)節(jié)有助于進(jìn)一步了解ET方案對自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響，以為乳腺癌靶向治療藥物的選擇與探索提供新的思路。

[1] SHEN M, DUAN W M, WU M Y, et al. Participation of autophagy in the cytotoxicity against breast cancer cells by cisplatin[J]. Oncology reports, 2015, 34(1): 359-367.

[2] MAYCOTTE P, THORBURN A. Targeting autophagy in breast cancer[J]. World J Clin Oncol, 2014, 5(3): 224.

[3] CAO Q H, LIU F, YANG Z L, et al. Prognostic value of autophagy related proteins ULK1, Beclin 1, ATG3, ATG5,ATG7, ATG9, ATG10, ATG12, LC3B and p62/SQSTM1 in gastric cancer[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(9): 3831.

[4] KIM T H, KIM H S, KANG Y J, et al. Psammaplin A induces Sirtuin 1-dependent autophagic cell death in doxorubicinresistant MCF-7/adr human breast cancer cells and xenografts[J].Biochim Biophys Acta, 2015, 1850(2): 401-410.

[5] OJHA R, BHATTACHARYYA S, SINGH S K. Autophagy in cancer stem cells: a potential link between chemoresistance,recurrence, and metastasis[J]. Biores Open Access, 2015, 4(1):97-108.

[6] LIU Z, XU J, HE J, et al. Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation[J]. Oncotarget, 2015, 6(33): 34329.

[7] 李彧, 陳暉, 蘇錦明,等. 干擾素λ1對Huh7細(xì)胞自噬相關(guān)基因ATG3、ATG5及Bcl-xl表達(dá)的影響[J]. 中華疾病控制雜志,2015, 19(11):1087-1091.

[8] SUMAN S, DAS T P, REDDY R, et al. The pro-apoptotic role of autophagy in breast cancer[J]. Br J Cancer, 2014, 111(2): 309-317.

[9] BAO L J, JARAMILLO M C, ZHANG Z B, et al. Nrf2 induces cisplatin resistance through activation of autophagy in ovarian carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(4): 1502.

[10] 鄭家芬, 譚超. 自噬相關(guān)基因Beclin1沉默對乳腺癌細(xì)胞阿霉素敏感性的影響研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2017, 44(16): 2992-2996.

[11] SHEN P, CHEN M, HE M, et al. Inhibition of ERα/ERK/P62 cascades induces “autophagic switch” in the estrogen receptor-positive breast cancer cells exposed to gemcitabine[J].Oncotarget, 2016, 7(30): 48501.

[12] RADOGNA F, DICATO M, DIEDERICH M. Cancer-typespecif i c crosstalk between autophagy, necroptosis and apoptosis as a pharmacological target[J]. Biochem Pharmacol, 2015, 94(1):1-11.

[13] 焦慶麗, 吳愛國, 邵國利, 等. 乳腺癌組織Beclin1和EMT相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)及其臨床意義探討[J]. 中華腫瘤防治雜志,2015, 22(18): 1456-1460.

[14] 周小果, 韓玉輝, 黨強(qiáng), 等. Atg3及自噬對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移的影響[J]. 腫瘤防治研究, 2017, 44(8): 525-529.

[15] PANDA P K, MUKHOPADHYAY S, DAS D N, et al.Mechanism of autophagic regulation in carcinogenesis and cancer therapeutics[C]//Seminars in cell & developmental biology. Academic Press, 2015, 39: 43-55.

[16] CHEN H I, TSAI H P, CHEN Y T, et al. Autophagy and apoptosis play opposing roles in overall survival of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Pathol Oncol Res, 2016, 22(4): 699-705.

[17] WU S, SUN C, TIAN D, et al. Expression and clinical signif i cances of Beclin1, LC3 and mTOR in colorectal cancer[J].Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(4): 3882.

[18] SHUHUA W, CHENBO S, YANGYANG L, et al. Autophagyrelated genes Raptor, Rictor, and Beclin1 expression and relationship with multidrug resistance in colorectal carcinoma[J]. Hum Pathol, 2015, 46(11): 1752-1759.