鎘脅迫下硅對水稻幼苗生長與生理響應(yīng)的影響

李天哲，陳愛婷，李 彩，楊 丹，何 娜，劉鳴達

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽 110866）

工業(yè)“三廢”的排放以及含鎘農(nóng)藥、肥料的不合理使用，導(dǎo)致農(nóng)田土壤鎘污染加劇，進而影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，對人類健康的潛在威脅日益加重。2014年發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，鎘居耕地重金屬污染首位[1]。鎘為非必需營養(yǎng)元素，微量即具有極強致毒性，可導(dǎo)致人體腎臟損害[2]，并對心血管、肌肉骨骼系統(tǒng)和女性生殖系統(tǒng)造成影響[3]。因此，治理農(nóng)田土壤鎘污染，保障農(nóng)產(chǎn)品安全具有重大意義。

鎘的活性受土壤理化性質(zhì)影響極大，不同類型土壤中鎘的植物毒性閾值不同[4]，通常土壤鎘積累到一定程度，便會對植物產(chǎn)生毒害作用。其毒害首先體現(xiàn)在分子水平上，誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧（ROS）合成積累，造成原生質(zhì)膜、細胞器等損傷，致使其生理指標(biāo)發(fā)生變化，表現(xiàn)出中毒癥狀，抑制其生長。關(guān)于硅可增強作物對鎘脅迫的抗性和耐受性，已得到各國學(xué)者廣泛認同[5-6]。其生物學(xué)機制包括四方面：一是硅抑制水稻對鎘的吸收和轉(zhuǎn)運，提高產(chǎn)量降低稻米鎘積累[7]；二是硅能夠激活水稻的抗氧化防御體系[8]，改變鎘脅迫下抗氧化酶活性[9]，緩解鎘對細胞質(zhì)膜的傷害[10]，降低ROS損傷；三是硅還可減緩鎘對玉米、白菜超微結(jié)構(gòu)的破壞，使細胞器更加完整，并提高葉綠素含量、葉綠素a/b比值和葉片氣孔導(dǎo)度，促進光合作用[11-12]；四是植物體內(nèi)的硅與鎘螯合形成共沉淀或代謝成失活產(chǎn)物來減輕鎘毒害[5]。

前人已對硅緩解水稻鎘毒害作用進行了廣泛的研究，但水培或土培試驗所用含硅物料多為硅酸鹽或爐渣等堿性物質(zhì)，這些物質(zhì)不但改變了介質(zhì)的pH，而且引入了伴隨陽離子[13]，這些伴隨陽離子也可降低鎘的生物有效性[14]；另一方面從細胞超微結(jié)構(gòu)角度，探討硅緩解鎘對水稻毒害作用機理尚鮮有報道。故本文通過水培試驗，在消除pH和伴隨陽離子影響的基礎(chǔ)上，從水稻幼苗生物量、葉片抗氧化酶活性和細胞超微結(jié)構(gòu)三方面入手，研究鎘脅迫下硅對水稻幼苗生長與生理響應(yīng)的影響，以期揭示硅緩解水稻鎘毒害作用機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試作物為水稻（Oryza sativa L.），品種為“遼粳9”。試驗所用硅為硅酸鈉（Na2SiO3·9H2O，含 SiO221%），鎘為氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）。水培營養(yǎng)液根據(jù)國際水稻研究所常規(guī)營養(yǎng)液的配方配制[15]，其組分為（mg·L-1）：NH4NO3114.3、NaH2PO4·2H2O 50.4、K2SO489.3、CaCl2158.2、MgSO4·7H2O 405、MnCl2·4H2O 1.875、（NH4）6·Mo7O24·2H2O 0.093、H3BO31.167、ZnSO4·7H2O 0.044、CuSO4·5H2O 0.039、FeCl3·6H2O 9.625、檸檬酸水合物14.875。試驗所用藥品均為分析純試劑。

1.2 水培試驗

本試驗于2016年8—9月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)污染土壤修復(fù)與利用實驗室進行。設(shè)置5個處理，除對照組CK外，各處理營養(yǎng)液中鎘初始濃度均為1 mg·L-1，按施硅量（以 SiO2計）分別為 0、50、100、150 mg·L-1，用 Si 0、Si 50、Si 100 和 Si 150 表示。用 HNO3中和Na2SiO3的堿性，并以Si 150處理為標(biāo)準，所有處理間Na+和NO-3的差異用NaNO3補齊；每組處理3次重復(fù)。

首先篩選籽粒飽滿的水稻種子，于10%H2O2中消毒15 min，再用純水洗凈后在（30±2）℃黑暗環(huán)境催芽24 h，待種子萌發(fā)后播于鋪滿濕紗布的方盤中育苗；待兩葉一心期，選擇健壯、均一的秧苗移植于含鎘和硅的營養(yǎng)液（3 L）中，每個重復(fù)10株，在Blue pard MGC-450BP光照培養(yǎng)箱（上海一恒）中培養(yǎng)，光照強度 300 μmol·m-2·s-1，晝夜時間和溫度分別為 16/8 h和28/20℃。每7 d更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)35 d后取出培養(yǎng)皿中水稻樣品，用純水洗凈并用濾紙擦干植株表面水分后備用。取15株水稻幼苗測生物量，5～10株測酶活指標(biāo)，5株觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3 測定方法

1.3.1 水稻幼苗生物量的測定

采集新鮮水稻樣品，用卷尺測量根頸部至幼苗頂端葉尖，即為株高；測量根尖到幼苗莖基部的長度，即為根長；株高、根長均10次重復(fù)。將樣品清洗干凈并吸干其表面水分，將莖葉和根部分開，于105℃殺青、75℃烘干至恒質(zhì)量，并稱量其干質(zhì)量；每組稱質(zhì)量5株，3次重復(fù)。

1.3.2 水稻幼苗葉片生理生化指標(biāo)的測定

CAT活性：過氧化氫滴定法；POD活性：愈創(chuàng)木酚比色法；MDA：硫代巴比妥酸比色法[16]。

1.3.3 水稻幼苗葉片超微結(jié)構(gòu)的觀測

采集各處理水稻幼苗并用純水洗凈后擦干，選取相同部位葉片切成1 mm×1 mm小塊，將其置于預(yù)冷的2.5%戊二醛中真空固定4 h（4℃），然后用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH=7.2）清洗 20 min（重復(fù) 3次），接著再將其轉(zhuǎn)移至1%鋨酸中固定4 h（4℃），然后取出以乙醇、丙酮梯度脫水，再用SPI-812樹脂包埋、浸透后用LeicaUC6超薄切片機切片（60～80 nm），最終用醋酸鈾-檸檬酸鉛在室溫下（25℃）進行雙染色后以純水洗凈后備用。

將樣品用日立H-7650透射電鏡觀察并以Gatan832數(shù)字成像系統(tǒng)拍照[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Origin 9.0軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅對鎘脅迫下水稻幼苗生長的影響

株高、根長、干質(zhì)量等指標(biāo)是衡量水稻幼苗生長的重要指標(biāo)。為了解鎘脅迫下硅對水稻幼苗生長的影響，在水培試驗結(jié)束后拍攝了不同處理的照片（圖1），并測定了水稻幼苗的株高、根長、干質(zhì)量（表1）。

由圖1可以看出，CK處理的水稻幼苗長勢最好，株高較高、莖葉粗壯、主根較長且側(cè)根較多；加鎘后Si 0處理中水稻幼苗矮小、根長較短且側(cè)根少、葉片稀少泛黃且有衰老跡象；Si 50、Si 100、Si 150處理的水稻幼苗的生長狀況有明顯改善，生物量顯著增加。由表1可知施硅顯著地增加了水稻幼苗的株高、根長，提高了干質(zhì)量。這表明施硅能緩解鎘對水稻幼苗的毒害[5，9]，促進其生長，且隨施硅量的增加，其緩解作用愈加明顯。

圖2 鎘脅迫下施硅對水稻葉片CAT活性的影響Figure2 Effects of Si application on catalase activity in rice leaves under Cd stress

圖1 鎘脅迫下施硅對水稻幼苗生長的影響Figure1 Effect of Si application on growth and development of rice seedlings under Cd stress

表1 鎘脅迫下施硅對水稻生物量的影響Table1 Effect of silicon application on biomass of rice under Cd stress

2.2 硅對鎘脅迫下水稻葉片過氧化氫酶活性的影響

鎘脅迫下植物體內(nèi)的H2O2等ROS代謝會加強并大量積累，可氧化細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子，對原生質(zhì)膜以及多種細胞器造成損傷。過氧化氫酶（CAT）是植物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，可專性分解其體內(nèi)的H2O2，確保機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在一定程度上緩解其因逆境脅迫帶來的過氧化危害。鎘脅迫下施加不同濃度硅對水稻幼苗葉片中CAT活性影響如圖2所示，與CK處理相比，鎘脅迫可抑制水稻葉片中CAT活性（P＜0.05）；施硅處理與 Si 0相比，鎘脅迫下施硅可提高其CAT活性（P＜0.05），且隨施硅量的增加，CAT活性呈上升趨勢，這與Srivastava等[9]的研究結(jié)果相一致。

CK處理中CAT活性處于較高水平，而Si 0處理中其處于較低水平，說明鎘抑制了CAT活性。研究表明，鎘脅迫下水稻抗氧化酶活性的升高或降低，取決于其受脅迫的應(yīng)激強度和持續(xù)時間[6，18]。雖然水稻在鎘脅迫下生成大量H2O2[10]，而CAT活性降低，可能其與暴露機體內(nèi)的高濃度鎘較長時間直接作用，誘導(dǎo)CAT失活有關(guān)；或由于其合成酶的蛋白質(zhì)組減少或受損導(dǎo)致[11]。施硅使CAT活性升高，可能由于CAT對H2O2的親和力較低，只能清除高濃度的H2O2有關(guān)[19]；還可能由于硅促進了水稻幼苗CAT的表達，從而使其活性顯著增加，緩解了鎘對水稻的毒害程度。

圖3 鎘脅迫下施硅對水稻葉片POD活性的影響Figure3 Effects of Si application on peroxidase activity in rice leaves under Cd stress

圖4 鎘脅迫下施硅對水稻葉片MDA含量的影響Figure4 Effects of Si application on the content of MDA in rice leaves under Cd stress

2.3 硅對鎘脅迫下水稻葉片過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶（POD）對底物無專一性，除了可清除H2O2外，還可氧化酚類和胺類化合物，參與植保素的合成，緩解植物因逆境脅迫帶來的危害。特別地，POD還是酚類氧化代謝過程中的關(guān)鍵酶，參與酚類物質(zhì)形成木質(zhì)素最后的聚合反應(yīng)，對木質(zhì)素的合成具有關(guān)鍵作用。

鎘脅迫下施加不同濃度硅對水稻幼苗葉片POD活性的影響如圖3所示，可以看出，CK處理中POD活性處于相對較低水平，鎘脅迫（Si 0）可使水稻葉片中POD活性顯著升高（P＜0.05）；與Si 0處理相比，鎘脅迫下施硅可顯著降低水稻葉片中POD活性（P＜0.05），且隨施硅量的增加活性呈下降趨勢。究其原因，可能由于水稻受鎘脅迫，體內(nèi)具有較高氧化性[10]，并發(fā)生應(yīng)激生理反應(yīng)，產(chǎn)生大量POD去分解過氧化物；或是參與合成大量木質(zhì)素[20]，使其自身木質(zhì)化增強，對鎘的毒害建立生理屏障，增強其抗逆能力，故而Si 0處理POD活性處于較高水平。施硅降低水稻葉片木質(zhì)素的合成，緩解其因鎘毒害引起的POD大量產(chǎn)生，使其早衰的程度有所緩解，促進水稻生長[21]，所以水稻葉片中POD活性隨著施硅量增加而逐漸降低。

2.4 硅對水稻幼苗葉片丙二醛含量的影響

丙二醛（MDA）是膜脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，會造成核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的交聯(lián)聚合，線粒體呼吸鏈的損傷以及纖維分子之間橋鍵的松弛等，是間接反映細胞膜脂過氧化程度的指標(biāo)。

鎘脅迫下硅對水稻幼苗葉片MDA含量的影響如圖4所示。與CK處理相比，鎘可使水稻幼苗葉片中MDA含量處于相對較高水平（P＜0.05）；與Si 0處理相比，施硅可顯著降低鎘脅迫下水稻葉片中MDA含量（P＜0.05），且隨施硅量的增加其含量降低。Si 0處理中，MDA處于相對較高水平，說明鎘脅迫誘導(dǎo)水稻的膜脂過氧化程度較高，質(zhì)膜受到的傷害較嚴重，且水稻向木質(zhì)化發(fā)展，出現(xiàn)早衰現(xiàn)象（如圖1）。施硅處理使MDA含量顯著降低，說明硅可以有效緩解細胞的膜脂過氧化作用[10]，緩解鎘毒害。如前文所述，硅通過影響抗氧化酶（CAT、POD）活性和MDA含量，緩解了膜脂過氧化作用，降低木質(zhì)素的產(chǎn)生，從而在一定程度上減輕了水稻因高ROS帶來的傷害。

2.5 硅對水稻葉片細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

鎘脅迫下不同硅水平處理水稻葉片細胞的透射電鏡照片如圖5所示?？梢钥闯觯珻K處理中，水稻幼苗葉肉細胞形狀規(guī)則，無質(zhì)壁分離現(xiàn)象，葉綠體較多且較飽滿、基質(zhì)片層較多，線粒體較多且緊挨葉綠體；Si 0處理中，細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，部分葉綠體的基質(zhì)片層松散、空間增大，嗜鋨顆粒數(shù)量較多、體積膨大[22]。Si 50～Si 150處理中，線粒體、淀粉粒數(shù)目逐漸增多，嗜鋨顆粒數(shù)量逐漸減少、體積縮小，葉綠體逐漸向細胞壁靠攏，最后緊貼細胞壁邊緣。說明硅有助于維持細胞的完整性、穩(wěn)定性。

研究表明，嗜鋨顆粒在過強的脂質(zhì)過氧化作用下大量存在[22]，而脂質(zhì)過氧化是形成氧自由基的連鎖反應(yīng)，會造成細胞損傷。前文提到硅降低了水稻體內(nèi)MDA含量，減弱了脂質(zhì)過氧化作用，從而減輕了鎘對細胞的損傷；施硅后嗜鋨顆粒數(shù)目減少、體積縮小，從細胞內(nèi)部微形態(tài)改善的角度印證了硅的這一作用，這與Xu等[23]的研究結(jié)果相一致。

圖5 鎘脅迫下施硅對水稻葉片細胞的影響Figure5 Effect of Si application on leaf cells of rice under Cd stress

圖6 鎘脅迫下施硅對水稻葉片細胞葉綠體的影響Figure6 Effect of Si application on chloroplast of rice leaves under Cd stress

細胞中線粒體的數(shù)目隨施硅量的增加逐漸增多，說明水稻呼吸旺盛，代謝活躍。施硅使線粒體向葉綠體緊密靠近，二者甚至處于嵌合狀態(tài)，這種結(jié)構(gòu)可促進葉綠體和線粒體間的氣體互換，并可通過線粒體的呼吸作用減輕葉綠體的過氧化傷害。

圖6為不同處理水稻葉片葉綠體的透射電鏡照片，可以看出，CK處理的葉綠體中嗜鋨顆粒呈規(guī)則圓形且數(shù)量較少，基質(zhì)片層較多、排列走向與葉綠體長軸方向相一致；Si 0處理中嗜鋨顆粒膨大且多，基質(zhì)變淡，部分基質(zhì)片層松散，基粒片層模糊、排列紊亂且方向不一致；隨施硅量的增加，嗜鋨顆粒逐漸變小、變少，片層結(jié)構(gòu)逐漸清晰、排列逐漸整齊。

類囊體是葉綠體的片層膜系統(tǒng)，其膜上集中著光合色素和氧化還原酶類。正常情況下，ROS的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡，當(dāng)水稻受到鎘脅迫，動態(tài)平衡將會打破，導(dǎo)致葉綠體片層結(jié)構(gòu)受到損傷，進而影響其光合作用。施硅后片層結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)、解體現(xiàn)象得到緩解，膜系統(tǒng)趨于正常，說明硅緩解了鎘對葉綠體的破壞，使水稻葉片的光合功能逐步恢復(fù)[24]。

各處理水稻葉片細胞線粒體的透射電鏡照片如圖7所示，可以看出，CK處理中，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)清晰完整，嵴數(shù)目較多；Si 0處理線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)部分解體、消失，嵴數(shù)量較少；隨施硅量的增加，線粒體雙層膜解體現(xiàn)象逐漸緩解，結(jié)構(gòu)趨于完整，嵴膨脹現(xiàn)象仍存在，但嵴數(shù)量明顯增加。施硅后線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，嵴的數(shù)目增多，三羧酸循環(huán)酶附著的內(nèi)膜表面積增加，從而使能源物質(zhì)有效轉(zhuǎn)化成ATP，呼吸作用逐步加強，最終增強水稻的抗鎘脅迫能力。

圖7 鎘脅迫下施硅對水稻葉片細胞線粒體的影響Figure7 Effect of Si application on mitochondrion of rice leaves under Cd stress

3 結(jié)論

鎘脅迫下，施硅提高了水稻植株CAT活性，降低了POD活性和MDA含量，緩解了膜脂過氧化和木質(zhì)化作用，使葉片細胞結(jié)構(gòu)趨于完整、有序，葉綠體及淀粉粒數(shù)目增多、嗜鋨顆粒減少并變小、片層排列逐漸整齊，線粒體及其嵴的數(shù)目增多、雙層膜結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，促進了水稻幼苗生長，增強了其抗鎘脅迫能力。本試驗結(jié)果表明，硅施加量為150 mg·L-1時，水稻幼苗緩解鎘脅迫效果最好。

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