人肝源性干細(xì)胞腹腔移植抗刀豆蛋白A誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的機(jī)制研究

樊 增，張 凱，洪 豐，畢研貞，劉銅軍，張保貴，張 惠，王全義，董冠軍，付興芹，段鐘平，陳 煜，張小蓓，李 亮，司傳平*

(1.濟(jì)南大學(xué)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250200；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272000；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 豐臺100069；5.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)與分子醫(yī)學(xué)研究所，山東 濟(jì)寧272000；6.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，山東 青島266071；7.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272000)

嚴(yán)重且持續(xù)的肝臟損傷最終會誘發(fā)肝臟功能衰竭，藥物、毒物、病毒、酒精、自身免疫疾病等多種因素均可導(dǎo)致肝臟損傷[1,2]。免疫介導(dǎo)的肝損傷是急性肝衰竭的重要病因之一。因此，探尋行之有效的免疫性肝病的治療方法意義重大。人肝源性干細(xì)胞具有多向分化的潛能，在肝細(xì)胞受損時可促其激活并進(jìn)行增殖分化，從而實(shí)現(xiàn)對肝損傷的修復(fù)。另外，該細(xì)胞以其較強(qiáng)的自我更新能力和較弱的免疫原性等優(yōu)勢，使其在終末期肝病治療領(lǐng)域擁有很高的應(yīng)用價值。我們前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明人肝源性干細(xì)胞腹腔移植可以有效保護(hù)刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[3]。本實(shí)驗(yàn)是前期結(jié)果的延續(xù)，旨在闡明人肝源性干細(xì)胞抗ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性C57BL/6小鼠72只，SPF級，6-8周齡，體質(zhì)量(22±3)g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK[魯]20140007。

1.1.2細(xì)胞與試劑 人肝源性干細(xì)胞1(human liver stem cells 1,HYX1)由本實(shí)驗(yàn)室洪豐教授建系存種。Q-PCR試劑盒(美國Vazyme公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo Fisher 公司)；ELISA試劑盒(美國Biolegend)，TUNEL染色試劑盒(瑞士Roche)，引物(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1人肝源性干細(xì)胞的培養(yǎng)、造模、干預(yù)、生化指標(biāo)檢測、病理學(xué)檢查同前期實(shí)驗(yàn)方法[3]。

1.2.2按照ELISA試劑盒要求測定血清中TNF-α、IL-10水平，按TUNEL染色試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.2.3qRT-PCR檢測肝組織TNF-α、IL-10 mRNA表達(dá)。按試劑盒說明抽提RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取4.0 μl的cDNA于10 μl反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測

注射ConA后12 h和24 h干預(yù)組小鼠血清ALT和AST水平較模型組顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同時間點(diǎn)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶變化

2.2 肝組織病理學(xué)檢查

ConA注射12 h后模型組小鼠可見多灶性細(xì)胞壞死并橋接壞死，界板不清，肝小葉消失，肝竇擴(kuò)張、充血，膽小管結(jié)構(gòu)不清；干預(yù)組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，界板清晰，僅見少許炎細(xì)胞浸潤匯管區(qū)。見圖2。

A：正常小鼠；B：模型組小鼠C：干預(yù)組小鼠

2.3 Elisa檢測血清TNF-α、IL-10水平

注射ConA后3 h、6 h和12 h干預(yù)組小鼠血清TNF-α水平較模型組均顯著降低(P<0.05)；而IL-10在6 h時干預(yù)組明顯高于模型組(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同時間點(diǎn)小鼠血清TNF-α、IL-10變化

2.4 qRT-PCR檢測肝組織TNF-α、IL-10表達(dá)

注射ConA后3 h、6 h、12 h和24 h干預(yù)組小鼠肝組織TNF-α表達(dá)水平較模型組均顯著降低(P<0.05)；而IL-10表達(dá)水平在6 h時干預(yù)組明顯高于模型組(P<0.05)，與血清變化基本一致。見圖4。

圖4 不同時間點(diǎn)小鼠肝組織TNF-α、IL-10 mRNA表達(dá)

2.5 小鼠肝臟細(xì)胞凋亡檢測

TUNEL結(jié)果提示，ConA注射后12 h模型組小鼠肝組織出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，呈片狀廣泛分布；而12 h干預(yù)組僅有少量凋亡細(xì)胞，呈散在分布。見圖5。

圖5 ConA注射后12 h肝組織凋亡檢測(TUNEL ×100)

3 討論

急性肝衰竭目前最有效的治療方式是肝臟移植，但該治療方法面臨諸多限制，例如肝源不足、費(fèi)用昂貴以及術(shù)后免疫排斥等，因此，其很難在臨床大規(guī)模開展[4]。較之肝臟移植存在的諸多不足，干細(xì)胞療法以其自身獨(dú)有的優(yōu)勢受到越來越多的關(guān)注[5]。對肝干細(xì)胞治療作用的深入研究將會對以后終末期肝病有效的臨床干預(yù)奠定良好的基礎(chǔ)。

促炎因子TNF-α、IFN-γ等大量釋放以及CD4+T細(xì)胞活化是ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷的主要特征，該病理過程伴隨肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞中的黏附分子以及肝細(xì)胞中的趨化因子活化，最終引起伴有中性粒細(xì)胞浸潤的細(xì)胞壞死。 IL-10 是已知較強(qiáng)的抑炎癥細(xì)胞因子,可抑制單核細(xì)胞依賴性Th 細(xì)胞增殖,并抑制Th1 類細(xì)胞因子的合成及其活性，具有抑制炎癥、保護(hù)組織作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，ConA注射后3 h、6 h、12 h干細(xì)胞干預(yù)組小鼠血清TNF-α水平較模型組均顯著降低，而IL-10水平在ConA注射后6 h明顯升高，肝組織TNF-α和IL-10的mRNA水平變化和血清學(xué)基本一致，說明人肝源性干細(xì)胞可能通過抑制促炎因子釋放、促進(jìn)抑炎因子表達(dá)來發(fā)揮其抗ConA誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷作用。

細(xì)胞凋亡是由一系列靜止的蛋白酶調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，又稱Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡，可在ConA誘導(dǎo)的肝炎模型中觀察到[6,7]。本實(shí)驗(yàn)凋亡結(jié)果證實(shí)人肝源性干細(xì)胞可以顯著抑制小鼠肝臟細(xì)胞凋亡，進(jìn)而表明人肝源性干細(xì)胞抗凋亡作用可能是其保護(hù)急性肝損傷的另一機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu T,Xia Y,Li J,et al.Shikonin Attenuates Concanavalin A- Induced Acute Liver Injury in Mice via Inhibition of the JNK Pathway[J].Mediators of Inflammation,2016,2016:2748367.doi:10.1155/2016/2748367.

[2]Zhao J,Zhang S,You S,et al.Hepatoprotective Effects of Nicotiflorin from Nymphaea candida against Concanavalin A-Induced and d-Galactosamine- Induced Liver Injury in Mice[J].Int J Mol Sci，2017，18(3).pii:E587.doi:10.3390/ijms18030587.

[3]畢研貞,樊 增,陳東風(fēng),等.人肝源性干細(xì)胞腹腔移植不同時間對ConA誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的對比研究[J].中華肝臟病雜志,2017,25(3):202.

[4]Maes M,Vinken M,Jaeschke H.Experimental models of hepatotoxicity related to acute liver failure[J].Toxicology and applied pharmacology,2016,290:86.

[5]Habeeb MA,Vishwakarma SK,Bardia A,et al.Hepatic stem cells:A viable approach for the treatment of liver cirrhosis[J].World Journal of Stem Cells,2015,7(5):859.

[6]Li S,Xia Y,Chen K,et al.Epigallocatechin-3-gallate attenuates apoptosis and autophagy in concanavalin A-induced hepatitis by inhibiting BNIP3[J].Drug design,development and therapy,2016,10:631.

[7]Mao Y,Wang J,Yu F,et al.Ghrelin reduces liver impairment in a model of concanavalin A-induced acute hepatitis in mice[J].Drug design,development and therapy,2015,9:5385.