北黃海慢原甲藻形態(tài)結(jié)構(gòu)與腹瀉性貝類毒素組成

勾玉曉，劉磊，李冬梅，梁玉波*

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院；2.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心：遼寧 大連116023)

腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)是由海洋有毒微藻等產(chǎn)生的富集于貝類體內(nèi)的一種生物毒素，人類食用后會出現(xiàn)腹瀉等中毒癥狀。該毒素在全球沿岸海域廣泛分布，其主要成分是大田軟海綿酸(okadaic acid, OA)毒素。OA毒素最初是從軟海綿(Halichondriaokadaii與H.melanodocia)中分離出來的[1]，后來發(fā)現(xiàn)海洋底棲性原甲藻(Prorocentrum)是大田軟海綿酸的主要來源，海洋底棲性原甲藻主要有利馬原甲藻(P.lima)[2]、凹形原甲藻(P.concavum)[3]、P.hoffmannianum[4]、P.maculosum[5]、P.belizaanum[6]和慢原甲藻(P.rhathymum)[7-8]等。海洋底棲性原甲藻大都具有毒性，這也是每當發(fā)現(xiàn)底棲原甲藻類新種時，便被標識為 “潛在有毒種”的原因[9]。原甲藻的傳統(tǒng)分類和鑒定主要以細胞形狀、細胞大小、甲片表面形狀及樣式、間插板形態(tài)以及鞭毛孔板的形態(tài)及排列樣式等為依據(jù)[10-11]。但僅憑形態(tài)學(xué)分類時常難以區(qū)分原甲藻的種類形態(tài)特征，分子遺傳學(xué)就是一種有效的輔助手段，現(xiàn)已得到廣泛的應(yīng)用。

慢原甲藻(P.rhathymum)在熱帶和亞熱帶海域較為常見，在中國、美國、科威特、馬來西亞等海域均有報道[7-8,12-13]。1992年4月，在美國的拉巴斯城加利福尼亞灣首次報道了慢原甲藻產(chǎn)生的赤潮現(xiàn)象[10]，赤潮海域牡蠣腸道和鰓部均發(fā)現(xiàn)了大田軟海綿酸中毒的病理學(xué)癥狀[14]。目前，慢原甲藻的毒素組成特征已有一些研究。1987年，在慢原甲藻的提取物中發(fā)現(xiàn)了具有溶血活性的物質(zhì)[15]，還可產(chǎn)生一系列脂溶性毒素，包括螺環(huán)內(nèi)酯毒素(spirolides)、江鰩毒素(pinnatoxins)和環(huán)亞胺毒素(gymnodimine)[16]。而后，在慢原甲藻中檢測出了腹瀉性貝類毒素(DSP)的主要成分——大田軟海綿酸[7-8]。

早期報道中認為可產(chǎn)生腹瀉性貝類毒素的底棲類甲藻，如P.lima，主要分布于熱帶，且北黃海腹瀉性貝類毒素的主要產(chǎn)毒藻為鰭藻[17]。本研究旨確定來自北黃海的慢原甲藻分類地位及其毒素組分，以期豐富北黃海貝類毒素信息。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2013年9月，在北黃海長山群島獐子島海域(39°14′57″N，122°34′44″E)用采水器采集海水樣品，水溫為21 °C，鹽度為28。取1 L用于形態(tài)學(xué)觀察及計數(shù)，用5%的戊二醛(V/V)固定，放于1 L樣品瓶中。分離微藻的樣品用兩個潔凈的1 L錐形瓶收集，并用低溫箱保存運回實驗室。將來自樣品采集海域的新鮮海水用0.25 μm針頭式濾膜過濾后放入96孔板細胞培養(yǎng)板中，每孔放入一個分離出的微藻單細胞。裝有微藻的細胞培養(yǎng)板用封口膜密封，放入光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中培養(yǎng)并每天觀察細胞情況，待細胞增長至每孔10個細胞，將細胞吸出至12孔細胞培養(yǎng)板中，最終擴增至50 mL錐形瓶中。培養(yǎng)條件為：光強3 000 Lx，光暗循環(huán)=12 h∶12 h(L/D)，溫度20 ℃[18]。

1.2 形態(tài)觀察

使用光學(xué)顯微鏡(Nikon Elipse 80i)觀察微藻細胞大體形態(tài)，再用1%熒光DAPI核型染料(V/V,Sigma-Aldrich, USA)處理微藻細胞，熒光顯微鏡下(Olympus IX71)觀察微藻細胞核位置。固定處于指數(shù)生長期的微藻細胞，隨機選取50個微藻細胞測量細胞直徑。取5%戊二醛固定樣品，約1 mL濃縮藻液加入1 mL 4%鋨酸溶液(V/V)二次固定，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液及去離子水漂洗后；經(jīng)系列梯度乙醇(30、50、70、80、90、95和100%)脫水，在每個梯度浸泡10 min。脫水后的樣品經(jīng)過臨界點干燥儀處理，噴金后在掃描電子顯微鏡(日本JEOL JCM-6000)下觀察。

1.3 核糖體18S rDNA序列分析

通過560 g低速離心收集5 mL處于指數(shù)生長期的微藻細胞，加入液氮冷凍處理。研磨5 min后，使用試劑盒(Genomic DNA，大連寶生物有限公司)提取DNA。將所提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后作為模板，對18S rRNA與ITS進行擴增，擴增引物為18SF(上游引物：5′-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3′; 18SR下游引物：5-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3′)和ITS4(上游引物：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；下游引物：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG-3′)[19]。PCR反應(yīng)體系共50 μL，包括25 μL Takara Premix TaqTM，上下游引物各0.5 μL，2 μL DNA模板，用去離子水定容至50 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72°C延伸2 min,共40個循環(huán); 72°C延伸10 min[19-20]。將PCR產(chǎn)物送于寶生物工程(大連)有限公司進行測序，將測序結(jié)果應(yīng)用Genbank上的BLAST軟件，將來自北黃海的慢原甲藻的ITS rDNA序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中慢原甲藻數(shù)據(jù)庫進行比對，使用MEGA 3.0軟件構(gòu)建分子生物學(xué)進化樹。

1.4 毒素提取

收集600 mL搖勻藻液，1 000 g 4 ℃離心20 min，去上清后將剩余的微藻細胞殘渣用2 mL 100%甲醇提取2次，合并提取液，再用甲醇定容至4 mL。取 1 mL上述提取液，用0.45 μm針頭式濾膜(Minisart-plus GF syringe filters, Sartorius)過濾，放入色譜瓶待測。為了驗證OA毒素酯類同系物的存在與否，需在上機檢測之前對樣品進行堿性水解，操作步驟如下：取1 mL上述甲醇溶液樣品于色譜瓶中，加入125 μL 2.5 mol/L NaOH溶液，放入76 °C恒溫箱，40 min后取出并冷卻至室溫，加入125 μL 2.5 mol/L HCl溶液中和樣品，最后用0.45 μm濾膜過濾至色譜瓶中待測[21]。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析檢測毒素。使用儀器為液相色譜儀(Dionex Ultimate 3000, USA)，配有TurboV型電噴霧離子源(Applied Biosystems, USA)的質(zhì)譜檢測器(API4000, USA)。進樣量10 μL，柱溫箱溫度40 °C。色譜條件設(shè)置為：以0.05%的氨水(V/V)為流動相A，0.05%的氨水(V/V)溶入90%的乙腈溶液(V/V)為流動相B，流速設(shè)置為0.4 mL/min。梯度洗脫程序為：10 min內(nèi)從10% B相升至90% B相，保持3 min后，再在2 min內(nèi)從90% B相減少到10% B相，最后恢復(fù)至初始狀態(tài)。使用X-Bridge C18(3 μm ×150 μm, 3.5 μm, Waters Corporation, USA)色譜柱。質(zhì)譜檢測時，首先使質(zhì)譜儀處于陰離子多反應(yīng)檢測(multiple reaction monitoring, MRM)模式，以每種毒素的[M-H]-型離子為母離子，特征碎片離子為子離子進行分析，每個成分的駐留時間為100 ms，具體的MRM參數(shù)條件如表1。其余參數(shù)設(shè)置如下：幕簾氣12 psi；離子噴霧電壓4 500 V；離子源溫度600 ℃；霧化氣13 psi，用分析軟件(AB science version 1.5.2, USA)對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

在普通光學(xué)顯微鏡下，來自北黃海的慢原甲藻呈橢圓形或卵圓形，顯黃褐色(圖1a—c)。在熒光顯微鏡下，可觀察到細胞前端有一個明顯的細胞核(圖1d)，處于細胞前半部分位置。沿著細胞長軸可觀察到一個類似巨核的區(qū)域結(jié)構(gòu)，當細胞處于衰亡期時，該結(jié)構(gòu)較早期細胞的要長，這可能與細胞分裂有關(guān)。觀察到細胞呈縱向二分裂。在掃描電子顯微鏡下，慢原甲藻甲片表面光滑，分布有刺胞孔(圖2a，2b)，殼面前端環(huán)鞭毛區(qū)有一個凹陷結(jié)構(gòu)，凹陷附近有6～7個刺胞孔，并由背脊延伸出一個小刺狀板塊[22-23](圖2b)。兩殼后面端的刺胞孔呈放射狀，垂直于殼邊緣的淺溝，數(shù)量基本與相關(guān)研究報道一致[10, 24-25]，左殼約90個，右殼面約70個，無擬孔，而墨西哥原甲藻殼面上存在著比刺胞孔更小的孔，這也是區(qū)分慢原甲藻與墨西哥原甲藻重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)[26]。

表1 毒素檢測質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MRM MS/MS parameters of each toxin

注：DTX(Dinophysis toxin)為鰭藻毒素；*為定量離子對。

圖1 北黃海慢原甲藻普通光顯微鏡圖像(a—c)和熒光 顯微鏡圖像(d)(標尺=15 μm)Fig.1 Light microscopy(a—c) and fluorescent microscopy(d) images of Prorocentrum rhathymum isolated from North Yellow Sea, China (scale bar=15 μm)

慢原甲藻原屬于熱帶或亞熱帶微藻。來自中國北黃海處于指數(shù)生長期的慢原甲藻，平均長度為(33.20±1.25) μm，寬度為(24.50±1.39) μm(n=50)，細胞明顯大于中國南海亞熱帶慢原甲藻藻株[22]，與分離自韓國濟州島的慢原甲藻大小接近[27]；亞熱帶的慢原甲藻又要比熱帶種個體稍大一些，處于溫帶的北黃海慢原甲藻比熱帶和亞熱帶的慢原甲藻個體均大一些[28-29]，符合同一物種處于熱帶和亞熱帶的個體大小相對于溫帶和寒帶要小一些的基本生物學(xué)規(guī)律。

圖2 北黃海慢原甲藻掃描電子顯微鏡圖像 右殼面觀(a);左殼面觀(b)，標尺=5 μm。Fig.2 Scanning electron microscopy images of Prorocentrum rhathymum isolated from North Yellow Sea, China Right valve view(a); left valve view (b), scale bar=5 μm.

觀察來自北黃海的慢原甲藻活體細胞發(fā)現(xiàn)，當浮游細胞自由運動時，兩條鞭毛自由舒展，呈波紋狀擺動；當鞭毛接觸到小顆粒物質(zhì)時，不斷運動將這些物質(zhì)輸送到鞭毛基部附近，細胞只在固定位置“打轉(zhuǎn)”。浮游細胞能夠產(chǎn)生黏液，使自身運動速度降低，黏液在培養(yǎng)液中以黏液絲(圖1b)和黏液泡(圖1c)兩種形式存在。在培養(yǎng)初期慢原甲藻具有很強的運動能力，在衰亡期分泌大量黏液，使其運動速度明顯降低。

2.2 核糖體18S rRNA序列分析

通過對來自北黃海的慢原甲藻株藻的核糖體18S rRNA基因進行測序，序列編號為MY-2。利用NCBI數(shù)據(jù)庫的核酸BLAST功能進行了序列相似性比較，發(fā)現(xiàn)其與P.rhathymum(EU287487)和P.tsawwassenense(EF657885)等遺傳相似性最高，親緣關(guān)系最近(圖3)。Luo等[22]也證實來自中國南海的慢原甲藻藻株與P.rhathymum(EU287487)同樣具有較高的遺傳相似性。

圖3 基于18S ITS序列的北黃海慢原甲藻藻株系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 18S ITS sequence data

2.3 毒素組成分析

取指數(shù)生長期的北黃海慢原甲藻提取液，通過液相串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測腹瀉性貝類毒素的主要成分，即OA和或DTX等。但結(jié)果中并未明確檢出OA(RT=8.40 min)和DTX1(RT=9.18 min)組分，而是在保留時間15.36 min時發(fā)現(xiàn)了與DTX1的特征碎片離子對(817.5/255.2，817.5/577.2)相同的色譜峰，且空白樣品對照中沒有出現(xiàn)這一峰譜(圖4)。樣品經(jīng)過水解后，保留時間從15.36 min漂移到15.21 min，并在14.21 min和15.21 min出現(xiàn)了兩個新的物質(zhì)峰形(圖5),推測可能是DTX1的衍生物或類似物。

近些年來，隨著液相質(zhì)譜檢測技術(shù)的快速發(fā)展，對腹瀉性貝類毒素等的脂溶性海洋生物毒素的檢測，均用液相串聯(lián)質(zhì)譜法進行毒素組分的定性和定量檢測。早期研究中多用小鼠生物法檢測腹瀉性貝類毒素的含量，實際上只是檢測了毒性，并不能確定毒素的具體組分[30-33]。

DTX1為聚醚類高分子化合物，可在貝類體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成多種形式的DTX1衍生物[34]。早期報道中對DTX1衍生物的研究多以貝類為研究對象[35-36]，藻類中鮮有報道[37]。腹瀉性貝類毒素的主要化學(xué)成分OA、DTX1、DTX2均易與脂肪酸進行?；磻?yīng)生成一系列的衍生物，且這些衍生物也同樣具有相應(yīng)的腹瀉毒性，但其經(jīng)口服后由于在人體內(nèi)的水解，毒性往往會出現(xiàn)延遲。早先的研究認為這些衍生物只存在于貝類體內(nèi)，是相應(yīng)毒素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。Suzuki等[37]曾證實了蝦夷扇貝體內(nèi)的DTX1的衍生物(7-O-acyl-DTX1)是由DTX1轉(zhuǎn)化而來。后來這些衍生物也在某些原甲藻或鰭藻體內(nèi)被檢測到[38-39]；Draisci等[40]成功從Dinophysisacuta中分離到了OA的衍生物并命名為DTX-2C，單離子檢測掃描模式(SIM)下其與OA存在相同的碎片離子，但保留時間存在明顯差異。本研究中慢原甲藻粗提液在保留時間RT=15.36 min處檢測到的未知色譜峰與DTX1擁有相同的碎片離子817.5/255.2，817.5/577.2，故推斷其為DTX1的衍生物的可能性較大，目前DTX1衍生物標準品匱乏[41-44]，具體化學(xué)結(jié)構(gòu)還需結(jié)合其他分析手段進行確認。

圖4 毒素標準峰形圖(a)與北黃海慢原甲藻提取液 峰形圖(b)Fig.4 Chromatogram of standard OA and DTX1 (a) and chromatogram of extracts in cultured Prorocentrum rhathymum from North Yellow Sea, China(b)

3 結(jié)論

慢原甲藻是多分布于于熱帶或亞熱帶的海洋微藻，本研究以從屬于溫帶的中國北黃海海域分離出的慢原甲藻藻株為研究對象，通過光鏡、熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡的形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合18S rRNA序列分析，發(fā)現(xiàn)該株藻與P.rhathymum(EU287487)和P.tsawwassenense(EF657885)等遺傳相似性最高，確認其為慢原甲藻。通過LC-MS/MS檢測該藻產(chǎn)生的毒素，但本研究限于毒素易于衍生化及DTX1標準品匱乏等原因未能明確慢原甲藻腹瀉性貝類毒素的主要組分，只根據(jù)碎片離子對和出峰漂移時間推斷其產(chǎn)物疑似DTX1衍生物。

圖5 經(jīng)過水解后北黃海慢原甲藻提取液的峰形圖Fig.5 Chromatogram of cultured Prorocentrum rhathymum after alkaline hydrolysis

參考文獻：

[1] Tachibana K, Scheuer P J, Tsukitani Y, et al. Okadaic acid, a cytotoxic polyether from two marine sponges of the genusHalichondria[J]. Am Chem Soc, 1981, 103(32):2469-2471.

[2] Murakami Y, Oshima Y, Yasumoto T. Identification of okadaic acid as a toxic component of a marine dinoflagellateProrocentrumlima[J]. Nsugaf, 1982, 48(1):69-72.

[3] Dickey R W, Bobzin S C, Faulkner D J, et al. Identification of okadaic acid from a Caribbean dinoflagellate,Prorocentrumconcavum[J]. Toxicon, 1994, 28(4):371-377.

[4] Morton S L, Bomber J W. Maximizing okadaic acid content fromProrocentrumhoffmannianumFaust [J]. Appl Phycol, 1994, 6(1):41-44.

[5] Zhou J, Fritz L. Okadaic acid antibody localizes to chloroplasts in the DSP-toxin-producing dinoflagellatesProrocentrumlimaandProrocentrummaculosum[J]. Phycologia, 1994, 33(6): 455-461.

[6] Morton S L, Moeller P D, Young K A, et al. Okadaic acid production from the marine dinoflagellateProrocentrumbelizeanumfaust isolated from the Belizean coral reef ecosystem [J]. Toxicon, 1998, 36(1):201-206.

[7] An T, Winshell J, Scorzetti G, et al. Identification of okadaic acid production in the marine dinoflagellateProrocentrumrhathymumfrom Florida Bay [J]. Toxicon, 2010, 55(3):653-657.

[8] Caillaud A, de la Iglesia P, Campàs M, et al. Evidence of okadaic acid production in a cultured strain of the marine dinoflagellateProrocentrumrhathymumfrom Malaysia [J]. Toxicon, 2010,55(3):633-637.

[9] Aligizaki K, Nikolaidis G, Katikou P, et al. Potentially toxic epiphyticProrocentrum(Dinophyceae) species in Greek coastal waters [J]. Harmful Algae, 2009,8(2):299-311.

[10] Cortés-Altamirano R, Sierra-Beltrán A P. Morphology and taxonomy ofProrocentrummexicanumand reinstatement ofProrocentrumrhathymum(Dinophyceae) [J]. J Phycol, 2003, 39(1):221-225.

[11] Hoppenrath M，Leander B S. Morphology and molecular phylogeny of a new marine sand-dwellingProrocentrumspecies,P.Tsawwassenensesp.nov.(Dinophyceae,Prorocentrales), from British Columbia, Canada [J]. J Phycol, 2008, 44(2):451-466.

[12] Liang J L, Wei-Hong H E, Long C, et al.Prorocentrumrhathymum——A new record of epiphytic dinoflagellates in South China Sea [J]. J Trop Subtrop Bot, 2011, 19(1):40-44.

[13] Saburova M, Al Yamani F, Polikarpov I, et al. Biodiversity of free-living flagellates in Kuwait’s intertidal sediments [J]. Bio Risk, 2009, 3:97-110.

[14] Pearce I, Handlinger J H, Hallegraeff G M. Histopathology in Pacific oyster (Crassostreagigas) spat caused by the dinoflagellateProrocentrumrhathymum[J]. Harmful Algae, 2005, 4(1):61-74.

[15] Yasumoto T, Seino N, Murakami Y, et al. Toxins produced by benthic dinoflagellates [J]. Bio Bull-US, 1987, 172(1):128-131.

[16] Tindall D R, Miller D M, Bomber J W. Culture and toxicity of dinoflagellates from ciguatera endemic regions of the world [J]. Toxicon, 1989, 27:83.

[17] 劉述錫, 樊景鳳, 王真良. 北黃海浮游植物群落季節(jié)變化[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2013(7):1173-1181.

[18] 劉俏, 龍麗娟. 環(huán)境因子對慢原甲藻(Prorocentrumrhathymum)生長的影響[J]. 熱帶海洋學(xué)報, 2013, 32(3):93-100.

[19] Douding L U, Wang H, Huang H, et al. Morphological and genetic comparison of two strains of aProrocentrumspecies isolated from Zhejiang coastal water of China and Masan Bay of Korea [J]. Chin J Oceanol Limn, 2011, 29(4):832-839.

[20] White T J, Bruns T D, Lee S B, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA Genes for phylogenetics [M]. PCR Protocols, 1990, 38:315-322.

[21] Hu T, Marr J, Freitas A S W D, et al. New diol esters isolated from cultures of the dinoflagellatesProrocentrumlimaand Prorocentrum concavum [J]. J Nat Prod, 1992, 55(11):1631-1637.

[22] Luo Z, Zhang H, Krock B, et al. Morphology, molecular phylogeny and okadaic acid production of epibenthicProrocentrum, (Dinophyceae) species from the northern South China Sea [J]. Algal Res, 2017, 22:14-30.

[23] Hoppenrath M, Chomérat N, Horiguchi T, et al. Taxonomy and phylogeny of the benthicProrocentrum, species (Dinophyceae)—A proposal and review [J]. Harmful Algae, 2013, 27(7):1-28.

[24] 梁計林, 何偉宏, 龍超,等. 慢原甲藻——南海熱帶附生甲藻新記錄[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2011, 19(1):40-44.

[25] Fukuyo Y. Taxonomical study on benthic dinoflagellates collected in coral reefs [J]. Nippon Suisan Gakk, 1981, 47(8):967-978.

[26] Loeblich A R, Sherley J L, Schmidt R J. The correct position of flagellar insertion inProrocentrumand description ofProrocentrumrhathymumsp. nov. (Pyrrhophyta) [J]. J Plankton Res, 1979, 1(2):113-120.

[27] An S L, Jeong H J, Jang T Y, et al. Morphology and molecular characterization of the epiphytic dinoflagellateProrocentrum, cf.rhathymum, in temperate waters off Jeju Island, Korea[J]. Ocean Sci J, 2013, 48(1):1-17.

[28] 劉俏, 龍麗娟. 慢原甲藻研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 39(15):184-187.

[29] Sadaf G, Saifullah S M. The dinoflagellate genusProrocentrum(Prorocentrales,Prorocentraceae) from the North Arabian Sea [J]. Pakistan J Bot, 2011, 43(6):3061-3065.

[30] Prassopoulou E, Katikou P, Georgantelis D, et al. Detection of okadaic acid and related esters in mussels during diarrhetic shellfish poisoning (DSP) episodes in Greece using the mouse bioassay, the PP2A inhibition assay and HPLC with fluorimetric detection [J]. Toxicon, 2009, 53(2):214-227.

[31] Ramstad H, Larsen S A T, Shen J L. The validity of two HPLC methods and a colorimetric PP2A assay related to the mouse bioassay in quantification of diarrhetic toxins in blue mussels (Mytilusedulis) [J]. Toxicon, 2001, 39(9):1387-1391.

[32] Louppis A P, Badeka A V, Katikou P, et al. Determination of okadaic acid, dinophysistoxin-1 and related esters in Greek mussels using HPLC with fluorometric detection, LC-MS/MS and mouse bioassay [J]. Toxicon, 2010, 55(4):724-733.

[33] Draisci R, Croci L, Giannetti L, et al. Comparison of mouse bioassay, HPLC and enzyme immunoassay methods for determining diarrhetic shellfish poisoning toxins in mussels [J]. Toxicon, 1994, 32(11):1379-1384.

[34] Marr J C, Hu T, Pleasance S, et al. Detection of new 7-O-acyl derivatives of diarrhetic shellfish poisoning toxins by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Toxicon, 1992, 30(12):1621-1630.

[35] Lee J S, Igarashi T, Fraga S, et al. Determination of diarrhetic shellfish toxins in various dinoflagellate species[J]. J Appl Phycol, 1989, 1(2):147-152.

[36] Suzuki T, Ota H, Yamasaki M. Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (dinophysistoxin-3) in the scallop Patinopecten yessoensis[J]. Toxicon, 1999, 37(1):187-198.

[37] Suzuki T, Beuzenberg V, Mackenzie L, et al. Discovery of okadaic acid esters in the toxic dinoflagellateDinophysisacutafrom New Zealand using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Sp, 2004, 18(10):1131-1138.

[38] Miles C O, Wilkins A L, Hawkes A D, et al. Identification of 45-hydroxy-46,47-dinoryessotoxin, 44-oxo-45,46,47-trinoryessotoxin, and 9-methyl-42,43,44,45,46,47,55-heptanor-38-en-41-oxoyessotoxin, and partial characterization of some minor yessotoxins, from Protoceratium reticulatum[J]. Toxicon, 2006, 47(2):229-240.

[39] Fux E, Smith J L, Tong M, et al. Toxin profiles of five geographical isolates ofDinophysis, spp. from North and South America[J]. Toxicon, 2011, 57(2):275-287.

[40] Draisci R, Giannetti L, Lucentini L, et al. Isolation of a new okadaic acid analogue from phytoplankton implicated in diarrhetic shellfish poisoning [J]. J Chromatogr A, 1998, 798(1/2):137-145.

[41] Vale P. Detailed profiles of 7-O-acyl esters in plankton and shellfish from the Portuguese coast[J]. J Chromatogr A, 2006, 1128(1/2):181-188.

[42] Koe W J D, Samson R A, Van H P, et al. Mycotoxins and phycotoxins in perspective at the turn of the millennium[J]. Chem Int, 2002, 24(1):23-23.

[43] Villalba A, Reguera B, Romalde J L, et al. Molluscan shellfish safety[M]//Quilliam M A, Vale P, Sampayo M A M. Direct detection of acyl esters of okadaic acid and dinophysistoxin-2 in Portuguese shellfish by LC-MS. Spain:Conselleria de Pesca e Asuntos Maritimos da Xunta de Galicia and the Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO, 2013:67-73.

[44] Furumochi S, Onoda T, Cho Y, et al. Effect of carbon chain length in acyl coenzyme A on the efficiency of enzymatic transformation of okadaic acid to 7-O-acyl okadaic acid [J]. Bioorg Med Chem Lett, 2016, 26(13):2992-2996.