AOX基因家族的結(jié)構(gòu)和功能特征分析

王慧 馬藝文 喬正浩 常彥彩 術(shù)琨 丁海萍 聶永心 潘光堂

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，成都 611130；2.通化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，通化 135007；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點實驗室，泰安 271018）

交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）廣泛存在于真菌、原生生物以及高等植物中［1］，1987年首次從枯苞（Sauromatum guttatum）中分離出AOX，隨后在擬南芥、煙草、黃瓜、葡萄、玉米、大豆、水稻等多個物種中均發(fā)現(xiàn)了AOX基因，且以家族形式存在［2］。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，AOX屬于二鐵羧酸氧化酶，來源于一種原始氧化還原酶，該酶能夠清除地球生命發(fā)生早期處于高度還原狀態(tài)的大氣中氧氣［3］，隨著長時期的共生進化，演化為線粒體中的AOX 酶［4-7］。

前人研究表明，AOX參與了植物線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中的抗氰呼吸途徑，具有抗氰化物活性，因此又被稱為抗氰氧化酶［8］。AOX不僅在維持植物正常生長代謝速率和代謝平衡中發(fā)揮了重要作用［9］，而且還在抑制自由基產(chǎn)生，植物抵御逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用［10］。Wanniarachchi等［11］分別對水稻和大麥進行鹽脅迫和干旱脅迫處理后，AOX1a和AOX1d表達水平顯著增強。Wang等［12］對擬南芥進行低溫脅迫處理后，AOX1a和AOX1c的表達量顯著增加。Panda等［13］對煙草進行鋁脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)AOX在鋁脅迫耐受中起關(guān)鍵作用，具有增強呼吸能力、減少線粒體氧化應(yīng)激負擔(dān)和提高煙草細胞生長的能力。此外，在鎘、鉻環(huán)境下，煙草、槐葉萍［14］和擬南芥［15］中AOX的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平同樣均有所提高。Liao等［16］將番茄葉片接種煙草花葉病毒（TMV）后，SlAOX1a的轉(zhuǎn)錄水平顯著增強，提高了對TMV的抵御能力。大量研究報道均證實了在植物體受到干旱、鹽堿、溫度、光照、重金屬等非生物脅迫時，AOX在響應(yīng)這些逆境脅迫中發(fā)揮了重要作用［11，17-23］。

為了進一步探究AOX的生理功能及其基因家族的基本特征，本研究針對玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、高粱（Sorghum bicolor）和大豆（Glycine max）8個物種，利用生物信息手段，開展了AOX基因家族的進化、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、順式作用元件和功能注釋等系列分析工作。玉米（Zea mays L.）是重要的糧食、飼料、能源和工業(yè)原料作物，同時也是當(dāng)今世界上種植面積最大的禾谷類作物，在保障我國國民經(jīng)濟發(fā)展和國家糧食安全中發(fā)揮了不可估量的作用［24］。目前關(guān)于玉米中AOX基因家族的生理功能鮮有報道，因此，本研究開展了玉米與其他7個物種AOX基因家族的共線性分析，同時對玉米自交系B73苗期進行了高溫、低溫、干旱、鹽堿脅迫處理，擬通過對玉米AOX基因家族表達模式的分析，為進一步挖掘AOX基因家族在玉米應(yīng)對非生物脅迫中的功能解析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取玉米自交系B73為供試材料，種子經(jīng)消毒后置于裝有營養(yǎng)土的苗缽中，在晝夜溫度為28℃/25℃，光暗周期為 14 h /10 h，相對濕度為70%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至三葉一心期時進行干旱（20% PEG6000溶液）、鹽堿（200 mmol/L NaCl+25 mmol/L Na2CO3）、高溫（40℃）、低溫（4℃）分別處理0、2、4、6、12和24 h。采集對照組與所有處理組根、莖、葉（均為3次重復(fù)），液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 AOX基因家族的鑒定 通過Ensembl Plant數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl.org/index.html）查找玉米、水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高梁和大豆的蛋白序列、CDS、genome、GFF、cDNA、GTF文件。從Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）內(nèi)下載植物AOX基因家族的HMM模型（PF0178）后，通過Hmmsearch鑒定各個物種中AOX基因家族的成員，將搜索閾值設(shè)為E ＜ 1e-5，篩選出具有AOX結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。利用植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）、HMMER v.3.2.1（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan）和Pfam數(shù)據(jù)庫進一步驗證蛋白序列，整合上述結(jié)果，進而得到8個物種中鑒定到的非冗余蛋白序列。利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）估算AOX蛋白序列的分子量（Mw）、理論等電點（pI）、GRAVY、不穩(wěn)定性指數(shù)（II）。同時，將獲得的序列提交至CELLO網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進行AOX蛋白的亞細胞定位預(yù)測。

1.2.2 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 使用ClustalX v.1.83（默認參數(shù)）對玉米、水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高梁和大豆8個物種AOX蛋白序列進行多重序列比較，利用MEGA X將比對后的序列構(gòu)建無根系統(tǒng)進化樹，根據(jù)進化關(guān)系對系統(tǒng)進化樹進行分組。

1.2.3 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析 從基因組注釋文件中獲取玉米、水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高梁和大豆8個物種AOX基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，遞交到基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/），并對所獲得的結(jié)果進行統(tǒng)計分析。利用在線網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器MEME（http://memesuite.org/tools/meme）識別AOX蛋白中所包含的保守基序（設(shè)置：最佳的motif 8，motif長度6-50，其它參數(shù)默認）。

1.2.4 共線性分析 不同物種基因之間的共線性分析，可以為研究物種進化關(guān)系提供參考依據(jù)。利用MCScanX鑒定玉米與其它7個物種（水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高梁、大豆）之間AOX的同源基因，同時利用Circos0.67工具可視化玉米與上述物種AOX基因之間的共線性關(guān)系。利用PAML軟件包的codeml程序計算Ka/Ks比值，Ka/Ks≤ 1表示純化選擇作用，Ka/Ks ＞ 1表示正向選擇。進化時間計算公式為T =（Ks/2λ）×10-6Mya，（λ =6.5×10-9）。

1.2.5 順式作用元件和miRNA靶位點預(yù)測 在玉米、水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高梁和大豆8個物種的基因組文件中獲得轉(zhuǎn)錄起始位點上游1.5 kb序列，遞交到PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）開展順式作用元件的鑒定工作。將8個物種AOX的cDNA序列提交至psRNATarget（http://plant grn.noble.org/psRNATarget/），搜索miRbase中所有的玉米miRNA，進而識別候選miRNA靶標。

1.2.6 AOX蛋白質(zhì)的GO注釋分析 將玉米、水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高梁和大豆8個物種中的AOX蛋白序列提交至KOBAS數(shù)據(jù)庫（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1），進行AOX蛋白的GO（gene ontology）注釋分析，整合預(yù)測后獲得的GO號一一對應(yīng)到AOX基因中。將每個基因獲得的GO號提交至在線WEGO（https://wego.genomics.cn/），使用默認參數(shù)對AOX基因GO注釋分析進行可視化。

1.2.7 非生物脅迫條件下玉米AOX基因家族的表達分析 RNA的提取和cDNA的合成分別采用東盛生物核酸純化試劑盒、康為世紀反轉(zhuǎn)錄試劑盒，并嚴格按照說明書進行操作完成。定量引物通過NCBI網(wǎng)站設(shè)計后，由青島擎科生物技術(shù)有限公司合成（表1）。以玉米18S基因作為內(nèi)參，通過熒光定量PCR分析玉米AOX基因家族在4種脅迫處理中的表達情況。采用艾科瑞生物的SYBR?GREEN Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒（含ROX）進行熒光定量PCR擴增，擴增反應(yīng)使用山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點實驗室ABI Quantitative PCRQ6-1熒光定量PCR儀。獲得定量數(shù)據(jù)后，使用Excel、Prism軟件和R-pheatmap包進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

表1 引物序列Table1 Prime Sequence

2 結(jié)果

2.1 AOX基因家族的鑒定

本研究在8個物種中共鑒定出35條編碼AOX蛋白保守結(jié)構(gòu)域的基因，其中在玉米、水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高粱和大豆中分別鑒定到4、4、5、5、3、6、4和4個AOX基因。8個物種中AOX蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果如表2所示，玉米、水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高粱和大豆的AOX基因分別主要分布在2號、2號和4號、3號、5號、8號、8號、6號、8號染色體上，具有成簇分布的特征。在這8個物種中，AOX蛋白的大小變異范圍為174-753 aa，平均長度為353 aa。AOX蛋白的分子質(zhì)量變異范圍為19.68-85.44 kD，等電點pI值介于5.44-9.49。GRAVY值介于-0.38-0.02，除StAOX_PGSC0003DMT400019710之外，其他AOX蛋白具有負重力值，表明AOX蛋白具有親水特性。通過對AOX蛋白的亞細胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)有24個AOX主要在細胞質(zhì)中表達，占總數(shù)的68.57%，其余11個AOX基因在周質(zhì)空間表達。

表2 8個物種AOX基因家族的鑒定及理化性質(zhì)Table 2 Identification and characteristic features of AOX gene family in eight species

2.2 系統(tǒng)進化樹

將本研究鑒定到的35個AOX蛋白序列以鄰接法構(gòu)建無根系統(tǒng)進化樹，根據(jù)系統(tǒng)進化關(guān)系，35個AOX蛋白可劃分為5個亞家族（圖1）。不同亞家族包含的AOX蛋白數(shù)量變化很大，D亞家族擁有最多數(shù)目的AOX（10個），其次是E亞家族（8個），而C家族僅有3個蛋白質(zhì)，是最小的亞家族。每個分支都包含至少2個物種AOX蛋白，表明這些物種的AOX蛋白是由共同祖先進化而來，并且在每個物種中都能夠獨立擴張。玉米的AOX基因主要分布在A、B亞家族，且這兩個亞家族中包含水稻、二穗短柄草、高粱的AOX基因，表明玉米與水稻、二穗短柄草和高粱有較近的親緣關(guān)系。

圖1 8個物種AOX基因的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of AOX in eight species

2.3 基因結(jié)構(gòu)

外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)變異是研究基因家族進化的重要依據(jù)。本研究35個AOX基因的外顯子數(shù)目為1-13個，外顯子長度介于22-677 bp，平均長度為258.74 bp。內(nèi)含子長度變化顯著高于外顯子，介于46-5 874 bp，平均長度為375.07 bp。E亞家族外顯子平均數(shù)目最多，4.85個外顯子；其次是D亞家族，平均含有4.8個外顯子。D亞家族是最大的亞家族，外顯子數(shù)目變異范圍大，擁有較高豐度的內(nèi)含子數(shù)目，同時其基因結(jié)構(gòu)比其它亞家族更為復(fù)雜。在系統(tǒng)進化樹中，位于相同亞家族的成員具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（圖2）。

由35個AOX蛋白保守結(jié)構(gòu)域鑒定結(jié)果（圖2）表明，共預(yù)測到了8個基序，其中基序1、2、3在35個AOX蛋白質(zhì)中均預(yù)測到，基序1和基序8分別位于N端和C端。聚集在同一個亞家族中的AOX蛋白更有可能具有相同的基序組成，表明相同亞家族的成員具有相似的進化歷程和生物學(xué)功能。

圖2 AOX基因家族的系統(tǒng)進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析Fig.2 Phylogenetic relationship，gene structure，and conserved motifs analysis of AOX

2.4 共線性分析

玉米與其它7個物種AOX基因的共線性關(guān)系分析結(jié)果（圖3）表明，玉米與擬南芥、水稻、高梁、二穗短柄草、番茄、大豆、馬鈴薯的AOX同源基因分別為1、3、4、4、1、2、2個。Ka/Ks表示非同義替換位點替換次數(shù)（Ka）與同義替換位點替換次數(shù)（Ks）的比值，可以推斷基因發(fā)生復(fù)制的時間和受到的進化壓力。所有同源基因比對的Ka/Ks的值均小于1，表明AOX基因在進化過程中受到強烈的純化選擇壓力（表3）。

表3 玉米AOX和其他7個物種之間直系同源AOX蛋白的Ka / KsTable 3 Ka/Ks for orthologous AOX proteins between Z.mays and other seven species

圖3 玉米與其他物種AOX基因的共線性分析Fig.3 Collinearity of AOX genes between maize and other species

2.5 順式作用元件和miRNA靶位點預(yù)測

本研究順式作用元件鑒定結(jié)果如圖4所示，在35個AOX基因中鑒定到1 215個調(diào)控元件與晝夜節(jié)律相關(guān)，其中大量順式作用元件與植物生長調(diào)控、不同組織和時期的特異性表達、激素響應(yīng)、光響應(yīng)和非生物脅迫響應(yīng)等相關(guān)。本研究共鑒定到43個功能性順式調(diào)控元件，其中參與細胞周期調(diào)控的MSA-like調(diào)控元件僅在2個基因中發(fā)現(xiàn)。在多數(shù)AOX基因中發(fā)現(xiàn)ABRE（響應(yīng)ABA，27個基因）、CGTCA-motif（響應(yīng) MeJA，28個基因）、TGACG-motif（響應(yīng)MeJA，28個基因）和G-box（響應(yīng)光，6個基因）等作用元件。此外，還發(fā)現(xiàn)了多個響應(yīng)脅迫的調(diào)控因子：在35個AOX基因中鑒定到62個傷口響應(yīng)相關(guān)的WUN-motif，7個AOX基因中鑒定到9個響應(yīng)低溫脅迫的LTR調(diào)控元件，16個AOX基因中鑒定到20個與干旱脅迫相關(guān)的MBS作用元件。通過順式作用元件鑒定發(fā)現(xiàn)，AOX基因在調(diào)控多種應(yīng)激響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有潛在功能。

圖4 AOX基因啟動子區(qū)域順式調(diào)節(jié)元件分析Fig.4 Characterization of cis-acting regulatory elements in the promoter region of these identified AOX genes

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，大小為21-25個核苷酸，它們通過引導(dǎo)靶標mRNA的裂解或抑制mRNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄后控制基因表達。本研究miRNA靶位點預(yù)測結(jié)果如表4所示，共發(fā)現(xiàn)11對miRNA-AOX相互作用組合，其中涉及到8個miRNA靶向作用的11個AOX基因。在11對相互作用模式中，其中有4個miRNA通過裂解轉(zhuǎn)錄使AOX基因沉默、7個miRNA通過抑制mRNA翻譯靶向作用于AOX蛋白。

表4 psRNATarget在線工具鑒定靶向作用AOX基因的假定miRNATable 4 List of putative miRNAs targeted AOX genes identified by psRNATarget online tool

2.6 AOX蛋白的GO注釋

GO（gene ontology）具有包括細胞成分（cellular component）、生物過程（biological process）以及分子功能（molecular function）在內(nèi)的3個相對獨立部分，可以實現(xiàn)與基因相關(guān)的數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化、挖掘與整合。本研究共注釋到45個GO號，利用WEGO對AOX基因進行GO注釋分析結(jié)果如圖5所示，所有AOX蛋白參與植物細胞器、細胞膜、其它亞細胞結(jié)構(gòu)的構(gòu)成以及參與催化細胞內(nèi)代謝、細胞分裂和細胞凋亡過程；一部分AOX蛋白參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物學(xué)調(diào)控、響應(yīng)逆境脅迫等途徑；只有極少數(shù)AOX蛋白參與植物生長發(fā)育和細胞分化過程。

圖5 AOX基因本體論（GO）注釋分析Fig.5 Gene ontology（GO）annotation analysis of AOX

2.7 非生物脅迫條件下玉米AOX基因家族的表達

在低溫、高溫、干旱、鹽堿脅迫條件下，玉米AOX基因家族在B73根、莖和葉片部位的qRTPCR分析結(jié)果如圖6所示，玉米AOX家族成員在不同的脅迫處理下呈現(xiàn)不同的表達特征。在低溫處理條件下，Zm00001d002434在葉片中呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，但在根中呈現(xiàn)先下調(diào)表達，隨后顯著上調(diào)表達趨勢，處理后24 h時表達量最高；在高溫處理條件下，Zm00001d002434、Zm00001d002436在葉片中處理的5個時期均呈現(xiàn)上調(diào)表達，并且Zm00001d002436在葉片中表達水平較高。在干旱處理條件下，Zm00001d002434在葉片和莖中5個時期均呈現(xiàn)下調(diào)表達，在根部處理后12 h、24 h顯著上調(diào)表達；Zm00001d017727在根部處理后12 h、24 h顯著上調(diào)表達；Zm00001d002436表達水平不受干旱處理影響。在鹽堿處理條件下，Zm00001d017727在處理后6 h的葉片、處理后4 h的莖和處理后4 h、12 h的根中分別顯著上調(diào)表達；Zm00001d002434、Zm00001d002435在處理后12 h的根部顯著上調(diào)表達。研究結(jié)果表明玉米AOX基因家族在抵抗非生物脅迫中具有重要作用。

圖6 4種脅迫條件下玉米AOX家族表達分析Fig.6 Expression analysis of AOX family in maize under four stress condition

3 討論

本研究首次在8個物種的全基因組范圍內(nèi)鑒定了AOX基因家族，利用生物信息學(xué)分析方法，對8個物種的AOX基因家族的基因結(jié)構(gòu)和功能兩個方面開展了一系列研究?；蚪Y(jié)構(gòu)方面，AOX的系統(tǒng)進化、染色體位置、外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)以及保守基序組成等一系列分析結(jié)果驗證了聚類分析結(jié)果的準確性。此外，還發(fā)現(xiàn)AOX基因具有成簇分布的特征，如玉米AOX家族中Zm00001d002434、Zm00001d002435、Zm00001d002436， 大 豆 AOX家族中KRH42153、KRH42154，高粱AOX家族中EES12781、EES12782、EES12783，馬鈴薯AOX家族 中 PGSC0003DMT400019707、PGSC0003DMT40-0019708、PGSC0003DMT400019709、PGSC0003DMT400019710，二穗短柄草AOX家族中KQJ84389、KQ-J84390、KQJ84391等均呈現(xiàn)成簇分布的特征。

基因功能方面：（1）通過啟動子分析鑒定到43種順式作用元件，其中包括器官發(fā)生、激素合成、光以及生物和非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，表明AOX基因可能在植物生長發(fā)育以及應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。這與前人報道AOX作用廣泛的研究結(jié)果一致［25］，本研究利用生物信息手段驗證了前人研究結(jié)果的可靠性。（2）通過miRNA靶位點預(yù)測，鑒定出11個靶向作用于AOX基因的假定miRNA。其中，miR395c通過引導(dǎo)靶標mRNA裂解作用于玉米Zm00001d002435基因。研究表明，在擬南芥中miR395c可以延遲擬南芥種子萌發(fā)［26］。本研究中預(yù)測的miRNA為揭示AOX基因參與控制植物生長發(fā)育以及應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供寶貴線索。（3）通過AOX基因GO注釋分析驗證了前人報道的AOX作為應(yīng)激蛋白，可以保護線粒體（AOX）免受各種氧化應(yīng)激條件的影響［27-31］。本研究對三葉期玉米幼苗進行了不同的脅迫處理，AOX家族成員在4種脅迫條件下呈現(xiàn)不同的誘導(dǎo)表達特征，暗示它們與逆境脅迫應(yīng)答之間的密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)Zm00001d002434基因在低溫脅迫、Zm00001d002436基因在高溫脅迫、Zm00001d002435基因在干旱脅迫、Zm00001d017727基因在鹽堿脅迫響應(yīng)中較為敏感，這與前人報道并不是所有的AOX基因響應(yīng)所有脅迫反應(yīng)結(jié)果一致［32］。因此，通過基因工程手段提高不同AOX的表達水平，有可能提高植物抵抗不同逆境脅迫的能力。

4 結(jié)論

本研究在玉米、水稻、擬南芥、二穗短柄草、番茄、馬鈴薯、高粱和大豆8個物種的全基因組范圍內(nèi)共鑒定到35個AOX基因，8個物種的AOX基因均具有成簇分布的特征。AOX基因在進化過程中保持了較高的保守性。AOX基因具有參與植物生長發(fā)育，調(diào)控多種應(yīng)激響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在功能。非生物脅迫下玉米苗期根、莖、葉中AOX基因的表達情況驗證了AOX基因在植物生長發(fā)育以及應(yīng)激反應(yīng)中的重要作用。