DEHP的降解及其對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

王佳斌 朱鳳曉 高娟 施維林*

1 背景及意義

PAEs是一類(lèi)重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1]，主要被用作塑料產(chǎn)品增塑劑[2]。PAEs與塑料分子主要依靠氫鍵和范德華力結(jié)合而不是共價(jià)鍵連接[3],因此PAEs極易在生產(chǎn)、使用和焚化掩埋等過(guò)程中釋放到水、空氣和土壤環(huán)境中。我國(guó)工農(nóng)業(yè)區(qū)土壤均已遭受PAEs不同程度污染[4]，含量一般在μg/kg至mg/kg數(shù)量級(jí)[5]。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯 (DEHP)，是一種重要的PAEs類(lèi)化合物，也是目前世界上應(yīng)用廣泛和生產(chǎn)量大的人工合成的有機(jī)污染物之一[6]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 DEHP的化學(xué)結(jié)構(gòu)

DEHP具有較好的脂溶性，對(duì)生物體和固體顆粒表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和性和吸附性[7]。DEHP和鄰苯二甲酸丁酯(DBP)，在大氣、水體、土壤和底泥中的檢出率和含量都較高[8]。例如廣州和深圳蔬菜生產(chǎn)基地土壤中的Σ6PAEs 為 3.0-45.7 mg/kg，DBP 和DEHP為主要組分，含量分別為ND-20.6 mg/kg和2.85-25.1 mg/kg[9]。DEHP 對(duì)生物體的慢性毒性效應(yīng)備受關(guān)注。雖然沒(méi)有明顯的急性毒性作用，但在大劑量情況下，對(duì)動(dòng)物具有致癌、致畸、致突變作用，顯示出較強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾性[10]。DEHP的主要代謝產(chǎn)物為MEHP，同DEHP一樣，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有致突變作用[11]，可對(duì)幼鼠生精功能造成損害[12]。因此，有必要加強(qiáng)DEHP（和MEHP）在環(huán)境中的降解機(jī)理方面的研究，研發(fā)有效的去除方法，以減少對(duì)生物健康造成的危害。

圖2 土壤中不同濃度DEHP和MEHP的降解注：標(biāo)有相同小寫(xiě)英文字母的處理之間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）

在環(huán)境中，PAEs的水解、光解和揮發(fā)速率非常緩慢，生物降解是其在環(huán)境中分解的主要途徑[13]。環(huán)境中PAEs的降解與分布在很大程度上取決于微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能差異，理解微生物介導(dǎo)的PAEs代謝機(jī)制可為PAEs環(huán)境歸趨研究與PAEs修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。但目前對(duì)PAEs(尤其是DEHP)降解菌群落結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)還非常有限[14]，對(duì)PAEs降解的微生物群落效應(yīng)研究還未展開(kāi)。因此，本文將考察不同土壤PAEs含量下，DEHP和MEHP的微生物群落效應(yīng)，以期揭示兩種重要污染物在不同狀態(tài)下的微生物代謝機(jī)理。

2 材料與方法

2.1 風(fēng)干土活化

取風(fēng)干保存的南京市江寧區(qū)蔬菜地土樣，添加無(wú)菌水至含水率約為60%的最大持水率，在25℃條件下培養(yǎng)10天，以穩(wěn)定和活化土壤微生物。每種處理需要土壤(7*3)*20=420 g(干重)。需土壤：420*5=2100 g(干重)。無(wú)菌對(duì)照，每種處理需要4*3*8=96 g(干重)；共 4 種處理，需土壤 384 g（干重）。

2.2 污染物溶液配制

10 mg/mL DEHP溶液：稱(chēng)700 mg DEHP于100mL藍(lán)蓋玻璃瓶中，準(zhǔn)確加入70 mL丙酮，蓋緊蓋子，搖動(dòng)瓶子后，超聲助溶。

10 mg/m L MEHP溶液：稱(chēng)700 mg MEHP于100m L藍(lán)蓋玻璃瓶中，準(zhǔn)確加入70 mL丙酮，蓋緊蓋子，搖動(dòng)瓶子后，超聲助溶。

2.3 土壤制備

CK:稱(chēng)取干重為 50 g（濕重 59.17 g）的土壤于240 mL玻璃瓶中，添加42 mL丙酮。待丙酮揮發(fā)完，倒入盛有干重為370 g（濕重437.87 g）土壤的陶瓷攪拌盆，拌勻。

DEHP100:稱(chēng)取干重為50 g的土壤，添加4.2 mL DEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）和37.8 mL丙酮。待丙酮揮發(fā)完，與干重為370 g的土壤拌勻。

DEHP1000:稱(chēng)取干重為50 g的土壤，添加42 mL DEHP溶液（dissolved in acetone,10mg/mL）。待丙酮揮發(fā)完，與干重為370g的土壤拌勻。

MEHP100:稱(chēng)取干重為50 g的土壤，添加4.2 mL MEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）和37.8 mL丙酮。待丙酮揮發(fā)完，與干重為370 g的土壤拌勻。

MEHP1000:稱(chēng)取干重為50 g的土壤，添加42 mL MEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）。待丙酮揮發(fā)完，與干重為370 g的土壤拌勻。

分裝100 mL錐形瓶中培養(yǎng)，每瓶含土20g（干重）。補(bǔ)充水分至60%最大持水量。

3 結(jié)果與討論

3.1 DE HP和M E HP的降解

圖3 不同濃度DEHP和MEHP對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

圖4 培養(yǎng)42天時(shí)，不同濃度DEHP對(duì)土壤中細(xì)菌群落的影響（門(mén)和屬水平）注：α-Pro、β-Pro、δ-Pro、γ-Pro和 unclassified-Pro分別表示 α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和unclassified Proteobacteria；藍(lán)色字體代表DEHP抑制菌群；*和**分別表示顯著性水平p＜0.05和p＜0.01。

土壤中DEHP100在21天及42天的平均降解率分別為42.1%及51.2%，DEHP1000在21天及42天的平均降解率分別為36.9%及46.0%（圖2），總體上在兩個(gè)濃度下，隨著時(shí)間的增加，降解率有一定程度的增加，但是DEHP100與DEHP1000降解率之間沒(méi)有顯著性差異。

本實(shí)驗(yàn)另設(shè)置了MEHP處理組，設(shè)置MEHP處理組是因?yàn)镸EHP是DEHP的重要代謝產(chǎn)物（通常經(jīng)微生物作用，DEHP首先被降解成MEHP），設(shè)置MEHP組可便于考察DEHP中間代謝產(chǎn)物的代謝菌群。圖2表示，土壤中MEHP100在21天及42天的平均降解率分別為99.7%及99.9%，DEHP1000在21天及42天的平均降解率分別為97.1%及98.1%，隨著時(shí)間的增加，降解率一定程度上有所增加，在21天及42天之間沒(méi)有顯著性的差異，但是較高濃度的MEHP1000的降解速率顯著低于低濃度的MEHP組的降解速率。實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MEHP或其他產(chǎn)物累積，表明在該土壤中DEHP的降解較為徹底。由于MEHP是DEHP的一種代謝產(chǎn)物，其分子量較小，因此MEHP在土壤中被微生物代謝的速率顯著高于DEHP。Cartw right[15]及Otton[16]等學(xué)者也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象。

3.2 DE HP和M E HP對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響（圖3）

另外分析了土壤中的細(xì)菌數(shù)量，在21天后，空白對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量為65.1（*105CFUs/g soil），DEHP100組為72.3（*105CFUs/g soil），DEHP1000為75.6（*105CFUs/gsoil）。DEHP的加入在一定程度上增加了這些異養(yǎng)菌的數(shù)量，但是效果不顯著。另外MEHP100組為65.5（*105CFUs/g soil），MEHP1000組為60.2（*105CFUs/g soil），與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異，沒(méi)有顯著增加異養(yǎng)菌數(shù)量，反而高濃度的MEHP處理組中細(xì)菌數(shù)量有所減少。42天后，在空白對(duì)照組中生物量為68.7（*105CFUs/gsoil），DEHP100為69.5（*105CFUs/g soil），DEHP 1000為70.3（*105CFUs/g soil）。DEHP的加入在同樣一定程度上增加了這些異養(yǎng)菌群的數(shù)量，但是效果不顯著。MEHP100為70.7（*105CFUs/g soil），MEHP1000為68.3（*105CFUs/g soil），與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異。Cartwright等人的研究也同樣發(fā)現(xiàn)DEHP1000ppm對(duì)土壤細(xì)菌總數(shù)沒(méi)有影響[15]。

3.3 DE HP對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

為了進(jìn)一步了解DEHP對(duì)微生物菌群的影響，本研究使用高通量測(cè)序的手段分析了不同處理土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成（圖4）。在實(shí)驗(yàn)土壤中，主要菌群為變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria），而其他常見(jiàn)菌群如酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和芽單胞菌門(mén)（Gemmati-monadetes）所占比例相對(duì)較低。在門(mén)水平上，DEHP處理對(duì)細(xì)菌菌群的影響不大，僅有兩個(gè)門(mén)被顯著影響：DEHP100處理顯著提高了α-變形菌綱（α-Proteobacteria） 的 豐 度 ， 以 及DEHP1000顯著降低了芽單胞菌門(mén)的豐度。

在屬的水平上，我們發(fā)現(xiàn)DEHP污染對(duì)多個(gè)細(xì)菌菌群有顯著影響。主要表現(xiàn)為：DEHP100顯著提高了變形菌門(mén)下α-和β-變形菌綱中的一些屬；DEHP1000則顯著提高了放線菌門(mén)下放線菌目中的一些屬。此外，兩者同時(shí)抑制了芽單胞菌門(mén)下的芽單胞菌屬(Gemmatimonas)?？赡艿脑蚴且延袌?bào)道的降解作用及碳代謝作用。

4 結(jié)論

不同濃度DEHP在土壤中降解均較慢，培養(yǎng)42天后降解約50%；其單酯降解產(chǎn)物MEHP在該土壤中可迅速降解，故DEHP降解過(guò)程中未檢測(cè)到MEHP產(chǎn)物殘留。培養(yǎng)42天后，DEHP污染對(duì)土壤細(xì)菌總數(shù)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著影響，表明其急性毒性較低。但兩種濃度下均顯著改變了一些菌群的相對(duì)豐度，可能會(huì)引起土壤微生物功能的改變。

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