miR146a及miR155表達(dá)與益賽普治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效及安全性的相關(guān)性研究*

佘若男，李 博，胡秋俠，吳系美，譚錦輝，胡建云，唐群芳，汪小平

（廣東省深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東 深圳 518109）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種可致殘的自身免疫性疾病，以累及關(guān)節(jié)的滑膜炎為病理特征，是臨床常見的風(fēng)濕病。由于病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其治療尚缺乏特異性手段。重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（rhTNFR：Fc）是治療RA的強(qiáng)力武器，國內(nèi)較早生產(chǎn)的rhTNFR：Fc的商品名為益賽普，經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)用于RA的治療。越來越多的證據(jù)顯示，益賽普聯(lián)合甲氨蝶呤（MTX）治療RA可使RA的多種臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室病情活動(dòng)指標(biāo)迅速得到改善，且治療安全性較高[1-3]。在使用益賽普聯(lián)合MTX治療RA的過程中存在一個(gè)重要問題，即約30%的RA患者使用了足夠療程的益賽普治療后病情無明顯改善。本研究中針對(duì)這部分患者，觀察了益賽普治療中國RA患者的療效，并探討其外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中miR146a及miR155的表達(dá)與益賽普治療RA的療效相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)（ACR）修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)；病情處于活動(dòng)期（關(guān)節(jié)腫脹數(shù)或壓痛數(shù)不少于3個(gè)；符合以下條件中的任意2個(gè)，隨訪當(dāng)天的晨僵持續(xù)時(shí)間不少于45 min，C反應(yīng)蛋白（CRP）不低于正常上限的1.5倍，血沉不低于28 mm/1 h；無結(jié)核、肝炎、腫瘤、多發(fā)性硬化、充血性心力衰竭、中樞性神經(jīng)脫髓鞘病變和淋巴瘤等疾?。蝗绻瑫r(shí)口服糖皮質(zhì)激素，其劑量（相當(dāng)于口服潑尼松的劑量）必須穩(wěn)定在不超過10 mg/d，且至少持續(xù)4周；如果正在同時(shí)服用非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，則要求其劑量已穩(wěn)定至少達(dá)2周；RA的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)是指關(guān)節(jié)炎以外的其他所有臨床表現(xiàn)，包括眼部病變、肺部病變、皮膚病變、類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、血液系統(tǒng)病變等[5]；簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)[4]：孕婦或哺乳期；嚴(yán)重的心、肺、腎、肝等臟器疾病或合并有血液、內(nèi)分泌等其他系統(tǒng)病變及病史；4周內(nèi)曾接受過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇治療；急性或慢性感染性疾病，包括活動(dòng)性結(jié)核；合并有惡性腫瘤或有惡性腫瘤家族史。

病例選擇：選擇我院門診或住院風(fēng)濕免疫科2013年6月至2016年3月收治的RA患者117例。其中，男18例，女 99例；年齡 21～74歲，平均（45±17）歲。

1.2 方法

所有患者均接受益賽普（三生國健藥業(yè)＜上海＞股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S20050058，規(guī)格為每支12.5 mg）聯(lián)合MTX治療，連續(xù)治療3個(gè)月。益賽普的給藥方法為每周1次，每次50 mg，皮下注射。

1.3 觀察指標(biāo)與療效判定標(biāo)準(zhǔn)

療效及安全性評(píng)估：記錄入選的RA患者在治療前及之后每個(gè)月的臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。主要包括全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿常規(guī)、腎功能、紅細(xì)胞沉降率（ESR）、CRP、類風(fēng)濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）及抗核抗體（ANA）等。血清中RF的測(cè)定采用免疫比濁法，抗CCP抗體的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法，ANA的測(cè)定采用間接免疫熒光法。

RA療效評(píng)估，采用歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）與美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）共同修訂的臨床緩解新標(biāo)準(zhǔn)[4]，全部滿足以下條件即為達(dá)到RA臨床緩解新的標(biāo)準(zhǔn)：疼痛關(guān)節(jié)數(shù)量不超過1個(gè)，腫脹關(guān)節(jié)數(shù)量不超過1個(gè)，患者整體評(píng)估得分不超過1，ESR低于15 mm/1 h（女）、20 mm/1 h（男）或 CRP 水平不超過 1 mg/dL[4]。收集并記錄在治療過程中發(fā)生的所有不良反應(yīng)，并分析不良反應(yīng)與益賽普的相關(guān)性，必要時(shí)采取相應(yīng)措施。

miR146a及miR155的表達(dá)水平檢測(cè)：治療前，采集外周血液15 mL，枸櫞酸鈉抗凝后用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離PBMC，用1倍體積的PBS洗滌2次后定容至1 mL，吹打混勻后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將以上PBMC轉(zhuǎn)移至1.5 mL無 RNA酶的EP管中，按Trizol法說明書提取總RNA，用核酸紫外分析儀檢測(cè)RNA濃度，保證光密度（OD260/280）位于 1.8～2.0，將 RNA 凍存于-80℃冰箱中備用。采用TaqMan?microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI公司），反應(yīng)體系為 15 μL，按說明說操作。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃5 min，然后4℃延伸。選用RUN6為內(nèi)參照。采用ABI公司的TaqMan?PCR試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL，按說明書操作。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95℃ 10min，然后95℃ 15s，60℃ 60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采取獨(dú)立 t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，采用 χ2檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療后，臨床緩解91例，其余26例未達(dá)到臨床緩解標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見表1和表2。

表1 RA患者的一般情況比較

表2 miR146a和miR155在各組RA患者PBMC的表達(dá)水平（±s）

表2 miR146a和miR155在各組RA患者PBMC的表達(dá)水平（±s）

項(xiàng)目miR146a miR155 RA患者（n=117）1.37 ± 0.62 1.86 ± 0.44緩解組（n=91）1.30 ± 0.62 1.87 ± 0.46未緩解組（n=26）1.59 ± 0.56 1.83 ± 0.33 t值-2.114 0.499 P值0.037 0.619

3 討論

microRNA通過與靶mRNA結(jié)合引起靶mRNA降解或翻譯受抑制，在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。一系列的研究證實(shí)，microRNA與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，如癌癥、糖尿病、心臟病、感染及某些風(fēng)濕病等，并有可能成為這些疾病的診斷、病情活動(dòng)性及療效判斷的標(biāo)志物，甚至成為潛在的治療靶點(diǎn)。microRNA為全面了解生命科學(xué)現(xiàn)象開了一扇新窗口，為疾病發(fā)生的機(jī)制與設(shè)計(jì)新的治療策略研究提供了新視角。microRNA的研究成為了分子醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，RA患者體內(nèi)miR146a的表達(dá)存在明顯異常，且還與RA患者體內(nèi)一些炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生及RA的病情活動(dòng)性與關(guān)節(jié)破壞相關(guān)[6-16]。以上研究結(jié)果提示，miR146a有可能在RA的發(fā)病中起了非常重要的作用，可能有助于RA的診斷及病情活動(dòng)性評(píng)估。

益賽普是目前國內(nèi)應(yīng)用較多的治療中重度RA的生物制劑，但對(duì)部分患者療效欠佳，且價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出多數(shù)RA患者的經(jīng)濟(jì)承受能力。因此，如能提前判斷出可能對(duì)益賽普治療預(yù)期反應(yīng)不好的RA患者，不再使用益賽普對(duì)這些RA患者進(jìn)行治療，不但可減輕其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且有利于及時(shí)換用其他治療藥物，爭(zhēng)取更好的療效。

本研究結(jié)果顯示，接受益賽普治療的117例RA患者在治療結(jié)束時(shí)，達(dá)到臨床緩解新標(biāo)準(zhǔn)的RA患者只有91例，這91例RA患者PBMC中miR146a的表達(dá)水平顯著低于未達(dá)到RA臨床緩解新標(biāo)準(zhǔn)的患者，但miR155的表達(dá)水平無顯著性差異。

目前，多數(shù)臨床研究將RA的臨床緩解定義為DAS28評(píng)分不超過2.6分。由于疾病活動(dòng)性評(píng)分28（DAS28）評(píng)分系統(tǒng)中疼痛關(guān)節(jié)數(shù)量的權(quán)重系數(shù)相對(duì)過大，故對(duì)于腫脹關(guān)節(jié)數(shù)目多于疼痛關(guān)節(jié)數(shù)目的RA患者，就顯得過于寬松。本研究中采用了EULAR與ACR共同制訂的RA的臨床緩解新標(biāo)準(zhǔn)，克服了DAS28的局限性，因此觀察結(jié)果更客觀且可靠[4]。

綜上所述，本研究結(jié)果初步表明，RA患者PBMC中miR146a的表達(dá)水平與益賽普治療RA的療效可能相關(guān)，且對(duì)于PBMC中具有較高miR146a表達(dá)水平的RA患者的療效更好。以后仍需更大的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，以期通過先檢測(cè)miR146a的表達(dá)水平來預(yù)測(cè)益賽普治療RA的療效。

[1]Lipsky PE，van der Heijde DM，St Clair E，et al.Infliximab and methotrexate in the treatment of rheumatoid arthritis.Anti-Tumot Necresis Factor Trial in Rheumatoid Arthritis with Concomitant Therapy Study Group[J].N Engl J Med，2000，343（22）：1594-1602.

[2]Maini RN，Breedveld FC，Kalden JR，et al.Sustained improvement over two years in physical function，structural damage，and signs and symptoms among patients with rheumatoid arthritis treated withinfliximabandmethotrexate[J].ArthritisRheum，2004，50（4）：1051-1065.

[3]侯 勇，張奉春，黃 烽，等.Infliximab治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的隨機(jī)雙盲平行多中心臨床試驗(yàn)[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006，10（11）：658-663.

[4]Cuchacovich M，F(xiàn)erreira L，Aliste M，et al.Tumour necrosis factor-alpha （TNF-alpha）levels and influence of-308 TNF-alpha promoter polymorphism on the responsiveness to infliximab in patients with rheumatoid arthritis[J].Scand J Rheumatol，2004，33（4）：228-232.

[5]Seitz M，Wirthmüller U，M?ller B，et al.The-308 tumour necrosis factor-alpha gene polymorphism predicts therapeutic response to TNF alpha-blockers in rheumatoid arthritis and spondyloarthritis patients[J].Rheumatology （Oxford），2007，46（1）：93-96.

[6]Lee YH，Rho YH，Choi SJ，et al.Association of TNF-alpha-308 G/A polymorphism with responsiveness to TNF-alphablockers in rheumatoid arthritis：a meta-analysis[J].Rheumatol Int，2006，27（2）：157-161.

[7]Lee YH，Ji JD，Song GG.Tumor necrosis factor-alpha promoter-308 A/G polymorphism and rheumatoid arthritis susceptibility：a meta analysis[J].J Rheumatol，2007，34（1）：43-49.

[8]Maxwell JR，Potter C，Hyrich KL，et al.Association of the tumour necrosis factor-308 variant with differential response to anti-TNF agents in the treatment of rheumatoid arthritis[J].Hum Mol Genet，2008，17（22）：3532-3538.

[9]Cimaz R，Cazalis MA，Reynaud C，et al.IL1 and TNF gene polymorphisms in patients with juvenile idiopathic arthritis treated with TNF inhibitors[J].Ann Rheum Dis，2007，66（7）：900-904.

[10]何偉珍，徐曉東，葉志中，等.英夫利昔單抗治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效預(yù)測(cè)因素研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（19）：3675-3677.

[11]Toonen EJ，Coenen MJ，Kievit W，et al.The tumour necrosis factor receptor superfamily member 1b 676T＞G polymorphism in relation to response to infliximab and adalimumab treatment and disease severity in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2008，67（8）：1174-1177.

[12]Liu C，Batliwalla F，Li W，et al.Genome-wide association scan identifies candidate polymorphisms associated with differential response to anti-TNF treatment in rheumatoid arthritis[J].Mol Med，2008，14（9-10）：575-581.

[13]Hassan B，Maxwell JR，Hyrich KL，et al.Genotype at the sIL-6R A358C polymorphism does not influence response to anti-TNF therapy in patients with rheumatoid arthritis[J].Rheumatology（Oxford），2010，49（1）：43-47.

[14]Hyrich KL，Watson KD，Silman AJ，et al.Predictors of response to anti-TNF-therapy among patients with rheumatoid arthritis：results from the British Society for Rheumatology Biologics Register[J].Rheumatology，2006，45（12）：1558-1565.

[15]Braun-Moscovici Y，Markovits D，Zinder O，et al.Anti-cyclic citrullinated protein antibodies as a predictor of response to anti-tumor necrosis factor-alpha therapy in patients with rheumatoid arthritis[J].Rheumatol，2006，33（3）：497-500.

[16]Ramasawmya R，F(xiàn)ae KC，Spina G，et al.Association of polymorphisms within the promoter region of the tumor necrosis factor-α with clinical outcomes of rheumatic fever[J].Mol Immunol，2007，44（8）：1873-1878.