高通量測序技術(shù)在瘤胃產(chǎn)甲烷菌群研究中的應(yīng)用

周 旭,閔 力,趙圣國,鄭 楠,2,王加啟

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100193；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

甲烷是全球溫室氣體排放量僅次于二氧化碳的溫室氣體，但是其在地球的升溫潛能值(Global warming potential，GWP)卻遠(yuǎn)高于CO2，約為CO2的25倍[1]。有研究表明，農(nóng)牧業(yè)排放甲烷占總甲烷排放量的40%，其中反芻動物釋放的甲烷比例最大，占據(jù)農(nóng)牧業(yè)甲烷排放量的25%，是甲烷排放的最主要來源[2]。另有研究表明，反芻動物瘤胃排放甲烷不僅會造成2%～12%的消化能損失，降低飼料利用率，而且導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能降低，養(yǎng)殖成本增加[3]。瘤胃甲烷減排已經(jīng)成為緩解環(huán)境溫室效應(yīng)和提高能量利用效率的重要途徑。因此，對反芻動物瘤胃產(chǎn)甲烷菌群的研究顯得尤為重要。

產(chǎn)甲烷菌(methanogen)在生物降解過程的最后一個環(huán)節(jié)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，影響甲烷的合成[4]。近年來，高通量測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于瘤胃產(chǎn)甲烷菌群的研究，它不僅能夠分析瘤胃產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)和功能，還能揭示瘤胃產(chǎn)甲烷菌群與環(huán)境之間的關(guān)系。因此，高通量測序技術(shù)的應(yīng)用對研究反芻動物瘤胃產(chǎn)甲烷菌群的多樣性與功能，尋找甲烷調(diào)控的靶標(biāo)菌群具有重要的指導(dǎo)意義。

1 瘤胃產(chǎn)甲烷菌的種類

產(chǎn)甲烷菌是一類獨(dú)特的微生物群體[5]。在產(chǎn)生甲烷的過程中，產(chǎn)甲烷菌含有一種參與甲烷代謝途徑的特殊低電位電子載體——F420輔酶因子，它能使瘤胃中約2.8%～4.0%瘤胃產(chǎn)甲烷菌氧化態(tài)時吸收420 nm左右的紫外光，激發(fā)出約470 nm的藍(lán)綠色熒光[6]。利用產(chǎn)甲烷菌具有的自發(fā)熒光的光譜學(xué)特征，可在紫外熒光顯微鏡下鑒定產(chǎn)甲烷菌的菌落或細(xì)胞[7]。此外，與其他細(xì)菌相比產(chǎn)甲烷菌在細(xì)胞膜的組成上也有所不同，產(chǎn)甲烷菌的細(xì)胞壁沒有胞壁酸，細(xì)胞膜的脂質(zhì)通過乙醚、類異戊二烯與甘油或者碳水化合物相結(jié)合[7]。通過16S rRNA分析其序列發(fā)現(xiàn)，反芻動物瘤胃中存在的古菌基本為嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)甲烷菌，能將無機(jī)或有機(jī)化合物厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)變成CH4和CO2[8]。一般而言，瘤胃產(chǎn)甲烷菌主要有5種，即：反芻獸甲烷短桿菌(Methanobrevibacterruminantium)、甲酸甲烷桿菌(Methanobacteriumformicicum)、巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinabareri)、馬氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinamazei)和活動甲烷微菌(Methanomicrobiummobile)[9]。近年來，還發(fā)現(xiàn)了未分類的熱原體古菌C簇甲烷菌(Rumen Cluster C/RCC)[10]。

2 高通量測序技術(shù)的特點(diǎn)

高通量測序技術(shù)能夠一次測定數(shù)百萬條DNA分子序列，有利于對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全面的研究分析[11]。高通量測序技術(shù)主要包括Roche公司的454焦磷酸測序技術(shù)、ABI公司的SOLID技術(shù)、Life Technologies的Solid技術(shù)、Illlumina公司的HiSeq和MiSeq技術(shù)Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)、Helicos Biosciences公司的單分子測序技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)[12-13]。表1對已實(shí)現(xiàn)商品化的三代測序平臺各自的特點(diǎn)進(jìn)行了比較。

表1 已實(shí)現(xiàn)商品化的三代測序平臺特點(diǎn)比較Table 1 Comparison of the characteristics on commercialized sequencing platform

目前，以Illumina測序平臺為代表的第二代測序平臺在通量、準(zhǔn)確度上都有較大的提高，同時測序成本也大幅度降低，成為商用測序的主流平臺。但在序列讀長方面，第二代測序技術(shù)比第一代測序技術(shù)要短很多。第三代測序技術(shù)通過現(xiàn)代光學(xué)、高分子、納米技術(shù)等手段來區(qū)分堿基信號間的差異，達(dá)到直接讀取序列信息的目的，在DNA序列片段讀長上優(yōu)于第二代，但在準(zhǔn)確度上比第二代稍差，價格也偏貴。未來隨著技術(shù)的改善，第三代測序?qū)⒏鼮榉€(wěn)定和成熟。

3 高通量測序在瘤胃產(chǎn)甲烷菌群基因組研究中的應(yīng)用

基因組數(shù)據(jù)對一個物種基因的組成結(jié)構(gòu)和不同物種間基因進(jìn)化關(guān)系的研究起著決定性的作用。國內(nèi)外的學(xué)者對瘤胃產(chǎn)甲烷菌群基因組進(jìn)行了大量的研究，目前已完成MethanobrevibacterruminantiumM1、Methanobrevibactersp. AbM4、MethanobacteriumformiciumBRM9、Methanosarcinasp. CM1、MethanobrevibactermilleraeSM9、Methanosphareasp. ISO3-F5等大部分瘤胃甲烷菌基因組測序項(xiàng)目[14-15]，并且研究者們還新發(fā)現(xiàn)了反芻動物瘤胃第二大產(chǎn)甲烷菌群甲烷菌第七目Methanomassiliicoccales[16-17]。通過對產(chǎn)甲烷菌基因組測序和注釋分析等組學(xué)的研究，可以發(fā)現(xiàn)其基因組中參與產(chǎn)甲烷途徑酶的編碼基因，推測產(chǎn)甲烷菌基本生理代謝途徑，分析出產(chǎn)甲烷菌的氧代謝、氫利用、一氧化碳代謝途徑和固氮的過程，全面了解未知產(chǎn)甲烷菌個體和群落的基本代謝信息，從而抑制甲烷菌的產(chǎn)生以及甲烷的排放。

4 高通量測序在瘤胃產(chǎn)甲烷菌群多樣性研究中的應(yīng)用

以往對瘤胃產(chǎn)甲烷菌群多樣性的檢測是通過mcrA或SSU rRNA數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物，qPCR擴(kuò)增檢測特定類菌群微生物數(shù)量，化學(xué)標(biāo)記物檢測產(chǎn)甲烷菌代謝附屬物等方法來分析瘤胃產(chǎn)甲烷菌的代謝情況[18]，但由于引物特異性低或代謝附屬物容易受到瘤胃中其他條件影響等因素，導(dǎo)致檢測精度低、獲得的信息量少[19]。而高通量測序技術(shù)能更高效用于檢測瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性的研究，對瘤胃復(fù)雜微生物環(huán)境中產(chǎn)甲烷菌的生物學(xué)信息進(jìn)行更加全面的檢測。能夠更加準(zhǔn)確、深入地分析瘤胃產(chǎn)甲烷菌群落的結(jié)構(gòu)組成、基因功能、代謝途徑。

表2比較了影響瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性的因素。由表2可知，動物的品種、飼糧配方等因素對瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性產(chǎn)生很大差異，存在這種差異的原因首先可能在于測序使用的引物不同[20-21]。Tajima等[22]用0025e/1492和D30/D33兩對引物對奶牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌種類進(jìn)行研究，結(jié)果表明由于引物擴(kuò)增效率的不同，使用引物0025e/1492所得到的產(chǎn)甲烷菌種類多于D30/D33。我們認(rèn)為，由于在不同模板中引物結(jié)合部位、周圍結(jié)構(gòu)、G+C含量等的不同，都會使部分模板優(yōu)先擴(kuò)增，而不同引物優(yōu)先擴(kuò)增的種類差異，就會引起菌群多樣性差異。因此，引物的差異、PCR擴(kuò)增的偏差、擴(kuò)增錯誤、測序錯誤等都可能降低菌群多樣性估計的準(zhǔn)確性。

表2 影響瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性的因素[19]Table 2 The effect of factors on rumen methanogens diversity

飼糧的差異是引起反芻動物瘤胃菌群數(shù)量變化和改變優(yōu)勢菌類型的決定性因素。Mccabe等[23]利用高通量測序技術(shù)研究了限制飼喂的牛體內(nèi)微生物的組成和變化，發(fā)現(xiàn)與自由采食組奶牛相比，琥珀酸弧菌屬在限制飼喂組奶牛瘤胃食糜液相和固相的豐度顯著降低，而產(chǎn)甲烷古菌在限制飼喂組奶牛瘤胃食糜中的豐度卻非常高，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)琥珀酸弧菌屬與產(chǎn)甲烷古菌之間存在一種爭奪底物的競爭關(guān)系。因此，我們推測不同飼糧可能通過影響瘤胃pH值和瘤胃發(fā)酵類型等因素，對瘤胃產(chǎn)甲烷菌種類多樣性和數(shù)量產(chǎn)生不同影響。

宿主動物和瘤胃微生物之間的選擇與進(jìn)化歷程的差異也可能引起瘤胃菌群多樣性的變化。Wallace等[24]為對比高產(chǎn)甲烷牛與低產(chǎn)甲烷牛瘤胃中產(chǎn)甲烷菌(和酶)的含量，采用Illumina Hiseq測序，將OUT代表序列與RIM-DB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，獲取每個OUT所對應(yīng)的分類學(xué)信息，通過計算相對豐度，得到細(xì)菌和古菌的比例，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)和低產(chǎn)甲烷牛在細(xì)菌、原生動物含量等方面大體相同，只有古菌含量方面存在顯著性差異(P<0.01)，說明極高產(chǎn)甲烷肉牛的古菌含量顯著高于極低產(chǎn)甲烷的肉牛的古菌含量。同時Wallace等[24]將Hiseq 序列與KEGG基因數(shù)據(jù)庫比對，通過功能豐度證明了高產(chǎn)甲烷牛的甲烷合成酶豐度高于低產(chǎn)甲烷牛。由此可知，反芻動物瘤胃菌群多樣性是宿主動物與瘤胃微生物強(qiáng)烈選擇與協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。

5 高通量測序在瘤胃產(chǎn)甲烷菌群功能代謝研究中的應(yīng)用

產(chǎn)甲烷菌在瘤胃中的主要代謝方式是利用H2和CO2生成CH4。有研究發(fā)現(xiàn)，Methanobrevibacter和Methanosphaera主要利用H2，同時Methanosphaera也能夠利用甲基營養(yǎng)途徑產(chǎn)甲烷[25]。該途徑包含兩種代謝模式，第一種為嚴(yán)格的甲基營養(yǎng)型模式，一部分甲基化合物被氧化產(chǎn)生CO2以及還原當(dāng)量，用于還原甲基化合物中的甲基基團(tuán)產(chǎn)甲烷[26-27]。這也是大多數(shù)甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的代謝途徑，它們僅以甲基化合物為底物產(chǎn)甲烷，第二種為H2依賴型代謝模式，以利用甲醇作為生成CH4的底物，以H2作為電子供體，還原甲基化合物中的甲基基團(tuán)產(chǎn)甲烷[28]，瘤胃未知甲烷菌群C簇[29-30]也是通過該途徑產(chǎn)甲烷。具體反應(yīng)過程見圖1。

圖1 產(chǎn)甲烷菌的代謝途徑

Fig.1 Metabolic pathways of methanogenesis

隨著基因改造、基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者對產(chǎn)甲烷菌的功能代謝和調(diào)控過程的認(rèn)識已越來越深入全面。Rubino等[31]對14頭奶牛的瘤胃微生物宏基因組進(jìn)行Illumina GAIIx平臺測序，發(fā)現(xiàn)甲烷短桿菌屬中的基因要比梭菌屬中的基因更豐富，在涉及某些特定代謝通路方面，普氏菌屬比甲烷短桿菌屬擁有更加多樣的功能異構(gòu)體，如丙酮酸氧化、羥基丙酸—羥基丁酸循環(huán)；而梭菌屬在半胱氨酸生物合成、甲醛同化/絲氨酸代謝、PRPP生物合成方面要比甲烷短桿菌屬擁有更加多樣的功能異構(gòu)體。表明普氏菌屬會優(yōu)先降解半纖維素，而當(dāng)木聚糖化合物生成后，纖維表面集群逐漸被梭菌所取代。Kamke等[32]以23只羊作為研究對象，通過Illumina HiSeq測序平臺對低甲烷產(chǎn)量羊瘤胃微生物特征進(jìn)行研究，KEGG注釋發(fā)現(xiàn)，與高甲烷產(chǎn)量樣品相比，調(diào)控氨基酸生物合成、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、半乳糖代謝以及短鏈脂肪酸代謝的基因在低甲烷產(chǎn)量羊瘤胃微生物中相對豐度更高，暗示這些基因可能與微生物產(chǎn)甲烷量有關(guān)，研究證明動物瘤胃容積越小、轉(zhuǎn)換率高、Sharpeaspp.和Megasphaeraspp.兩種微生物富集是最終導(dǎo)致低甲烷產(chǎn)量形成的原因。Hoedt等[29]對澳大利亞袋鼠前胃樣品微生物多樣性進(jìn)行分析，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)甲烷古菌純化與分離，然后對分離得到的微生物(WGK6)進(jìn)行鑒定和功能分析，發(fā)現(xiàn)WGK6與Methanosphaerastadtmanae(DSMZ 3091T)具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，WGK6能夠利用乙醇產(chǎn)生甲烷，同時可生成乙酸鹽，推測該菌在H2或乙醇存在時參與甲醇還原過程。因此，高通量測序技術(shù)不但可以清楚地了解目的產(chǎn)甲烷菌的代謝過程和系統(tǒng)發(fā)育的位置，而且利用高通量測序技術(shù)與蛋白質(zhì)組、基因組、代謝組等其他分子生物學(xué)研究手段的結(jié)合，能夠更加深入的了解復(fù)雜瘤胃微生物產(chǎn)甲烷菌群功能基因表達(dá)與調(diào)控的方式，為鑒定甲烷代謝調(diào)控靶點(diǎn)提供更多的信息，進(jìn)而了解甲烷的產(chǎn)生機(jī)制和抑制甲烷的產(chǎn)生。

6 小 結(jié)

瘤胃產(chǎn)甲烷菌群落是反芻動物特有的微生物群落，需要不斷探索和研究。近年來，在瘤胃產(chǎn)甲烷菌群落的研究中高通量測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，可以檢測未知序列的特征，為部分不可培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷菌提供了很好的平臺，具有尋找新基因的作用。但在實(shí)際的操作中，一方面應(yīng)注意這些技術(shù)本身存在的不足和研究過程中不穩(wěn)定因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響，另一方面要注意瘤胃中菌群樣品本身的特殊性。因此，如何應(yīng)用高通量測序技術(shù)，從復(fù)雜環(huán)境中定向檢測生長條件苛刻、但是具有特殊生態(tài)學(xué)功能的產(chǎn)甲烷古菌，了解反芻動物瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)，將是一個必須面對和解決的關(guān)鍵問題。

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