參芍軟肝湯抗大鼠肝纖維化的療效及其對肝星狀細胞活化及凋亡的影響

丁曉明 江 波 徐鴻婕 曾江琴 劉黎明

(武漢大學附屬同仁醫(yī)院 武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，湖北 武漢 430060)

Friedman〔1〕認為，肝臟損傷-肝實質(zhì)炎癥、壞死-肝星狀細胞(HSC)激活-大量細胞外基質(zhì)(ECM)沉積，是其核心環(huán)節(jié)。當不同刺激因素如肝炎病毒、毒性物質(zhì)如酒精、四氯化碳(CCl4)等、脂肪代謝產(chǎn)物、炎性因子等作用于肝臟可損傷肝細胞，刺激Kupffer細胞產(chǎn)生不同的細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1等從而導致HSC激活。HSC是肝纖維化的細胞學基礎〔2〕。在正常狀態(tài)下，HSC處于肝竇周圍間隙中，通過釋放可溶性炎性因子和產(chǎn)生ECM來促進肝細胞間相互作用。當肝臟受到各種刺激因素的作用發(fā)生損傷后，HSC將被激活〔3〕?；罨腍SC分泌更多的ECM，包括α平滑肌動蛋白(SMA)、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ等，此外HSC也分泌基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)促進ECM降解，當合成的ECM多于其降解，平衡受到破壞將會導致肝纖維化〔4～7〕。目前抗肝纖維化的治療可作用于肝纖維化形成過程中的任何一個階段，而HSC的持續(xù)激活是肝纖維化的重要因素，因此抑制HSC的活化狀態(tài)減少ECM的沉積被認為是有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化的一個方法〔8〕。

近年來，中藥在防治肝纖維化方面取得了不少進展。本項目組前期就開展了活血燥濕、化瘀軟肝法治療肝病的臨床與實驗研究〔9，10〕，并初步認識到活血燥濕、化瘀軟肝類制劑在防治脂肪肝、肝纖維化、肝癌的療效及其作用，認識到抗肝纖維化的療效與其調(diào)整免疫功能、防止肝損傷、糾正蛋白比例失調(diào)、促進微循環(huán)、改善肝臟病理的作用相關。而參芍軟肝湯復方制劑(丹參、白芍、郁金、海藻、制鱉甲、垂盆草、女貞子等)，目前已嘗試用于臨床治療肝纖維化，但是關于其中的機制仍需研究。本文研究參芍軟肝湯對CCl4誘導的大鼠肝纖維化的治療作用，通過檢測肝纖維化程度的血清學指標透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ-C型膠原(Ⅳ-C)和Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)和血清中冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(ALB)的表達水平，觀察參芍軟肝湯能否逆轉(zhuǎn)CCl4誘導的大鼠肝纖維化，并探討參芍軟肝湯對HSC活化與凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1細胞及主要試劑 HSC-T6為永生化的大鼠HSC系，該細胞系已知幾乎保留活化HSC的所有功能，α-SMA表達陽性，本研究以傳代12代以內(nèi)用作實驗。RPMI1640和胎牛血清購自美國Gibco公司；CCl4購自南京博全科技有限公司；參芍軟肝湯復方制劑含丹參、白芍、郁金、海藻、制鱉甲、垂盆草、女貞子、制附片、茯苓、炙甘草10味中藥；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；Real Time-PCR試劑(SYBR Green Master Mix)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BD公司；全自動生化分析儀檢測大鼠血清ALT、AST和ALB生化指標為美國貝克曼公司，大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自南京安培化工科技有限公司，檢測儀器為美國Biotek酶標儀。

1.2動物 清潔級 Sprague-Dawlay(SD)大鼠購自湖北中醫(yī)藥大學動物實驗中心。共32只，雄性，體重(180±20)g。建立肝纖維化模型：將SD大鼠隨機分為正常對照組和肝纖維化模型組各16只，其中模型組大鼠皮下注射40% CCl4植物油溶液(1 ml/kg)，2次/w，持續(xù)8 w，制成大鼠肝纖維化模型。正常對照組以同樣方法注射等量植物油。動物分組：正常對照組隨機分為正常組8只，藥物組 8只，建模組隨機分為模型組 8，治療組8只。藥物組及治療組在造模同時給藥，每次劑量為2 g/kg，溶于生理鹽水中灌服，灌胃2次/w，其他組同期灌服相當量的生理鹽水溶液。

1.3血清樣本的測定 實驗進行8 w末處死各組大鼠，取下腔靜脈血液，分離血清樣本。全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST和ALB生化指標，同時ELISA法測定血清中HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ的水平。

1.4藥物血清的制備 將上述分離的各組大鼠血清，于56℃熱滅活30 min，過濾除菌，加入RPMI1640培養(yǎng)液，配制成10%的培養(yǎng)基。然后將HSC-T6以1×105密度接種于6孔板，每組4復孔，同時用無血清的RPMI1640饑餓培養(yǎng)24 h，使細胞周期同步于G0期。 24 h后用上述四種血清繼續(xù)培養(yǎng)18 h，分別用于收取細胞用于提取RNA和細胞凋亡檢測。

1.5Real Time-PCR法 用Trizol收取上述四組不同處理的血清培養(yǎng)的HSC-T6，用氯仿抽提法得細胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，應用羅氏熒光定量PCR Lightcycler 480采用三步法進行定量檢測實驗，反應條件第一步預變性95℃ 5 min，第二步循環(huán)反應(設置40個循環(huán)數(shù))95℃ 10 s，60℃ 30 s，溶解曲線95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。所用引物見表1。

表1 Real Time實驗中檢測基因的上下游引物序列

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 上述四組細胞分別用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑標記后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗，應用GraphPad Prism4.0軟件作圖。

2 結 果

2.1各組血清肝功能指標的變化 與正常組比較，模型組ALT、AST、ALB表達水平明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，治療組ALT、AST表達水平明顯降低，ALB水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.2各組血清肝纖維化 4項指標的變化 與正常組比較，模型組HA、LN、Ⅳ-C、PC-Ⅲ明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，治療組HA、LN、Ⅳ-C、PC-Ⅲ明顯降低(P<0.05)，見表3。

2.3參芍軟肝湯對HSC-T6活化的影響 與正常組相比，藥物組α-SMA和TGF-β1 mRNA的表達水平受到明顯抑制(P<0.01)，與模型組相比，治療組α-SMA和TGF-β1 mRNA的表達水平明顯降低(P<0.001)。見表4。

2.4參芍軟肝湯對HSC-T6凋亡的影響 與正常組相比，藥物組能明顯促進HSC-T6的凋亡水平(P<0.001)，與模型組相比，治療組HSC-T6細胞的早期凋亡和總的凋亡水平也明顯增加(P<0.001)。見表5。

表2 各組血清中ALT、AST、ALB的表達水平比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，表3同

表3 各組肝纖維化血清指標的變化

表4 各組肝臟α-SMA和TGF-β1 mRNA表達的比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.001；表5同

表5 參芍軟肝湯對HSC-T6凋亡率的影響

3 討 論

肝纖維化是機體對各種致病因素引起的慢性肝損傷后的一種自我修復反應，盡管早期的肝纖維化臨床癥狀不是很明顯，但當肝臟受到持續(xù)的損傷時，肝纖維化可進一步發(fā)展成肝硬化，肝硬化可導致一系列嚴重的并發(fā)癥，如門脈高壓、肝性腦病和肝衰竭等。有報道顯示，肝硬化5 年、10 年后發(fā)展成肝癌的概率分別為17%、40%〔13〕。目前肝移植是嚴重肝病唯一有效的治療措施，但肝纖維化在某種程度上可逆轉(zhuǎn)〔14〕。 因此有效的抗纖維化藥物十分必要〔15〕。其中HSC激活是肝纖維化過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)，在正常肝臟中，HSC主要的功能是存儲維生素A，然而，當肝臟受到損傷，HSC活化，活化的HSC可導致肝纖維化。所以誘導HSC凋亡可能有助于纖維化終止〔16，17〕。HSCs 凋亡是一個生理性的過程，由細胞外的調(diào)節(jié)因素與其細胞表面的受體結合，經(jīng)活化的受體啟動胞內(nèi)第二信號系統(tǒng)，激活核酸內(nèi)切酶，引起DNA 裂解，進而引發(fā)細胞凋亡，表現(xiàn)為一種程序化細胞形態(tài)學改變過程。HSCs 吞噬的凋亡小體可能直接刺激肝纖維化。抑制HSCs激活、誘導其凋亡環(huán)節(jié)是逆轉(zhuǎn)肝纖維化進展的一個有效治療靶點。因此，抑制HSCs 激活，促進其凋亡，是肝纖維化逆轉(zhuǎn)的主要機制。基礎和臨床研究證實有效的病因治療、抑制細胞外基質(zhì)的合成或促進其降解，肝纖維化甚至早期肝硬化也是可以恢復的。目前對慢性肝病的病因治療已有了一定的手段，如抗病毒藥物的運用對控制乙肝和丙肝的病情發(fā)展起積極作用，但卻不能完全取代抗肝纖維化治療，因為對于已經(jīng)形成的肝纖維化其療效是有限的，甚至有些慢性肝病即使病因去除了，但肝纖維化的發(fā)展卻沒有停止。目前較公認的治療肝纖維化的藥物有γ干擾素，丹參類制劑、桃仁類制劑及活血化瘀法、益氣活血制劑。

目前研究的藥物大部分單一地作用于肝細胞或者星狀細胞。參芍軟肝湯有活血燥濕、疏肝化瘀、清熱解毒等作用，可以緩解肝硬化的發(fā)生發(fā)展，目前已在臨床用于預防與治療肝纖維化。其組方藥物應用于不同的靶細胞，減少肝細胞凋亡，抑制星狀細胞活化，從而達到增加星狀細胞凋亡的效果，較好地作用于肝纖維化的治療。本研究結果提示了參芍軟肝湯可以明顯減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。抑制HSC的激活過程可能是參芍軟肝湯減輕肝纖維化的一個機制。參芍軟肝湯另一方面是通過促進HSC凋亡來實現(xiàn)減輕肝纖維化的目的。肝纖維化的治療一般是作用于肝纖維化的不同過程，尤其是其中激活HSC的環(huán)節(jié)，而參芍軟肝湯明顯抑制活化的HSC表達α-SMA和TGF-β1，同時促進活化的HSC凋亡，從根本上減少ECM的沉積，逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程。另外，有文獻報道，層黏連蛋白、膠原蛋白Ⅳ及膠原纖維的增生是導致肝硬化惡化的重要原因〔18，19〕。參芍軟肝湯中的成分如丹參、白芍、鱉甲等能促進ECM中膠原的降解，而海藻、女貞子和炙甘草還能起到保護肝細胞的功能，促進肝細胞的再生，從而間接阻止肝纖維化的進展。中醫(yī)理論認為，肝纖維化過程中肝細胞的解毒、合成等功能受到干擾，進而引起氣滯血瘀、肝失疏泄、肝血不足、脾胃運化失調(diào)等病理變化〔20〕。通過調(diào)節(jié)肝臟氣血、改善血淤、散熱解毒等方式，可以改善間質(zhì)代償性增生〔21〕。另外中藥大部分來源天然植物，減少了藥物本身的毒副作用，且中藥的治療強調(diào)整體觀念，各成分之間相互制約又相互補充，形成“多靶點”的協(xié)同作用，臨床療效顯著。

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