長期有氧運動對去卵巢大鼠骨組織中內(nèi)源性硫化氫生成的影響

王 兵 石 瓊

(西安工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安 710032)

目前世界衛(wèi)生組織已經(jīng)把骨質(zhì)疏松列為中老年三大疾病之一，在常見病中該病的發(fā)生率居第7位〔1〕。目前骨質(zhì)疏松的治療途徑多種多樣，主要包括藥物療法及運動治療等。雖然藥物療法的療效比較顯著，但由于存在潛在的副作用和患者心理上和經(jīng)濟(jì)上的壓力等原因，多數(shù)患者無法堅持長期治療。而運動療法由于不存在副作用，往往被骨質(zhì)疏松患者廣泛接受并能長期堅持。臨床和動物實驗均發(fā)現(xiàn)有氧運動有助于延緩或減輕老年患者或相關(guān)模型動物的骨質(zhì)疏松的發(fā)生進(jìn)程〔2～4〕。然而其中相關(guān)的分子機(jī)制至今尚未被完全闡明。硫化氫(H2S)被視為一種污染大氣的有毒氣體；而最近研究發(fā)現(xiàn)H2S是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號分子。內(nèi)源性H2S主要由3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚β合酶、胱硫醚γ分解酶催化合成〔5〕。研究顯示H2S的合成減少可能參與了細(xì)胞和組織的老化過程，其中機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、SIRT1蛋白的激活、年齡相關(guān)基因Klotho的調(diào)節(jié)等〔6,7〕。本研究探討長期有氧運動對去卵巢大鼠內(nèi)源性H2S生成的影響。

1 資料與方法

1.1動物和試劑 12周齡雌性SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)，RIPA 裂解液、RT-PCR試劑盒(Roche羅氏生物試劑)，丙二醛(MDA)試劑盒(上海碧云天生物科技實驗室)，封口膜(PARAFILM公司)。

1.2動物模型和有氧運動 成年雌性SD大鼠30只,隨機(jī)分為3組,每組10只。假手術(shù)組只切除卵巢旁脂肪組織;其余20只切除卵巢,分為去卵巢組和運動組。上述大鼠試驗期間在相同的實驗條件下給予普通飼料。術(shù)后1 w后，開始運動治療。自制大鼠用跑臺，放置于電動跑步機(jī)上，傾斜角度10°，第1～2周，每天30 min，速度為8 m/min；第3～4周，每天45 min，速度為12 m/min；接下來的8 w，每天60 min，速度為20 m/min。假手術(shù)組和去卵巢組大鼠僅放置于跑臺上，但不轉(zhuǎn)動跑臺，放置時間與運動組相同。

1.3骨密度(BMD)和骨礦物質(zhì)含量及生物力學(xué)指標(biāo)檢測 處死大鼠，剝離左側(cè)股骨，使用DEXA雙能X線BMD儀檢測大鼠股骨BMD和骨礦物質(zhì)含量；采用電子萬能試驗儀檢測股骨最大負(fù)荷和剛度。

1.4血漿H2S含量檢測 處死大鼠，收集血漿；配制NaHS標(biāo)準(zhǔn)品(10、20、40、60、80 μmol/L)，將H2S探針NDS-Az溶于純酒精中(2.2 mmol/L)，使用96孔板(黑底)，每孔加入NDS-Az探針溶液10 μl，然后加入100 μl的血漿溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，輕微振蕩以達(dá)到混勻的目的。激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長528 nm，通過酶標(biāo)儀讀取數(shù)值，最后計算標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個樣本血漿中硫化氫的濃度。

1.5胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶mRNA含量檢測 處死大鼠，剝離右側(cè)股骨，液氮中磨碎，Trizol溶液抽提總RNA，定量后反轉(zhuǎn)錄，過程按照說明書進(jìn)行，靶標(biāo)基因的引物如下：3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶：上游引物5′-ggctcagtaaacatcccattc-3′； 下游引物5′-tgtccttcacagggtcttcc-3′。胱硫醚β合酶：上游引物5′-atgctgcagaaaggcttcat-3′； 下游引物5′-gtggaaaccagtcggtgtct-3′。 胱硫醚γ分解酶：上游引物5′-cgcacaaattgtccacaaac-3′；下游引物5′-gctctgtccttctcaggcac-3′。將GAPDH設(shè)為內(nèi)參，上游引物5′-gagctgaatgggaagctcac-3′； 下游引物5′-aaaggtggaggagtgggagt-3′。采用ABI7500定量PCR儀進(jìn)行檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1長期有氧運動對去卵巢大鼠骨質(zhì)的影響 與假手術(shù)組相比，去卵巢組股骨BMD和骨礦物質(zhì)含量明顯下降；而長期有氧運動可以顯著增加股骨BMD和骨礦物質(zhì)含量(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，去卵巢組股骨極限負(fù)荷和剛度明顯下降；而長期有氧運動可以顯著增加去卵巢大鼠股骨極限負(fù)荷和剛度(均P<0.05)。見表1。

2.2長期有氧運動對去卵巢大鼠內(nèi)源性H2S合成的影響 與假手術(shù)組相比，去卵巢大鼠血漿H2S水平明顯下降；而長期有氧運動可以顯著增加去卵巢大鼠血漿H2S水平(均P<0.05)。與假手術(shù)組大鼠相比，去卵巢大鼠股骨中H2S合成相關(guān)酶：胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶表達(dá)明顯降低(均P<0.05)，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；而長期有氧運動可以顯著增加去卵巢大鼠股骨中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶表達(dá)水平(均P<0.05)，但是對3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。見表2。

2.3長期有氧運動對去卵巢大鼠MDA的影響 與假手術(shù)組大鼠相比，去卵巢大鼠血漿MDA水平明顯增加(P<0.05)；而長期有氧運動可以顯著減少去卵巢大鼠血漿MDA水平(P<0.05)。見表2。

表1 長期有氧運動對去卵巢大鼠的股骨骨質(zhì)及股骨生物力學(xué)特性的影響

與去卵巢組比較：1)P<0.05，下表同

表2 長期有氧運動對去卵巢大鼠內(nèi)源性H2S合成的影響

3 討 論

在人、鼠等哺乳動物的多種組織和器官中都證實具有內(nèi)源性H2S的存在〔8,9〕。H2S在體內(nèi)有兩種存在形式：1/3以H2S分子態(tài)存在；2/3以H2S鈉鹽形式存在。兩者之間存在動態(tài)平衡，這樣既保持了組織內(nèi)H2S含量的穩(wěn)定，又維持內(nèi)環(huán)境酸堿度的平衡〔10〕。H2S的脂溶性較高，非常容易通過細(xì)胞膜進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運，這一點對于其在骨組織中的功能和作用具有重要意義。

在MC3T3-E1成骨細(xì)胞中，H2S治療可以對抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)骨鈣蛋白的表達(dá)〔11〕。長期糖皮質(zhì)激素的使用可以導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，研究發(fā)現(xiàn)地塞米松刺激MC3T3-E1成骨細(xì)胞，可以抑制細(xì)胞內(nèi)胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表達(dá)；而給予H2S供體治療可以減輕地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞活力下降和凋亡發(fā)生〔12〕。有研究顯示單劑量硫氫化鈉的治療可以引起RANKL的表達(dá)上調(diào)和破骨細(xì)胞分化的短暫增加〔13〕。另有研究發(fā)現(xiàn)H2S供體治療可以抑制癌細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化并在離體實驗中抑制骨質(zhì)溶解的發(fā)生〔14〕。另外，H2S供體治療還可以抑制尼古丁和脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞的破骨細(xì)胞性分化〔15〕；在牙周炎大鼠模型中，H2S治療后，牙糟中破骨細(xì)胞數(shù)目明顯下降〔16〕。在人間質(zhì)干細(xì)胞中H2S供體治療可以下調(diào)RANKL/OPG比例，從而抑制了破骨前體細(xì)胞的分化〔17〕。體外實驗發(fā)現(xiàn)，H2S還可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性，而該酶對于降解骨組織中彈力纖維具有重要作用〔18〕。在去卵巢大鼠中，雌激素的缺乏誘導(dǎo)了骨質(zhì)疏松的同時，抑制了骨組織中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表達(dá)；在去卵巢小鼠血清中H2S含量明顯降低〔19〕。這一點在本文的研究中得到進(jìn)一步的證實。給予去卵巢小鼠以H2S供體GYY4137治療，可以增加骨生成，減輕雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失〔19〕，提示雌激素缺乏后，內(nèi)源性H2S的生成減少是促進(jìn)動物骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵因素之一。

前期研究發(fā)現(xiàn)長期有氧運動可以增加高血壓大鼠主動脈中內(nèi)源性H2S的生成，從而起到血管保護(hù)的作用〔20〕。另有一項研究顯示太極運動可以增加原發(fā)性高血壓患者血漿H2S的含量〔21〕。本研究提示有氧運動可以通過上調(diào)骨組織中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表達(dá)，從而增加內(nèi)源性H2S的生成，抑制氧化應(yīng)激，最終有助于減輕由于雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松。

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