右美托咪定對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷心肌組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷的影響

任國強 陳 萍 于金貴

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院麻醉科山東省精神衛(wèi)生中心，山東 濟南 250014)

近年來，急性心肌梗死的發(fā)病人數(shù)和年齡有著明顯升高和年輕化的趨勢〔1,2〕。目前，心肌血運重建術(shù)是臨床上急性心肌梗死治療的主要手段，而缺血再灌注損傷(I/R)是影響治療過程中常見生理病理因素。右美托咪定(Dex)是一種在血管疾病圍術(shù)期起到麻醉和鎮(zhèn)痛作用的常用藥物。已有大量文獻證實，Dex對I/R有一定的改善作用，但其具體的作用機制尚不明確〔3～6〕。本研究從炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)出發(fā)，探討Dex改善I/R的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 健康SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量220～250 g，購于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，Dex購于江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購于杭州四季青公司。放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和總RNA提取試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65和血紅素加氧酶(HO)-1蛋白、β肌動蛋白(β-actin)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于美國Santa Cruz公司。K-H灌流液配方參照鄭凌云等〔7〕研究。Langendorff灌流系統(tǒng)和張力換能器連接多道生理信號采集系統(tǒng)購于成都儀器廠。

1.2方法

1.2.1大鼠實驗分組及離體心臟I/R模型的制備 實驗分組：將30只大鼠隨機分為對照組、I/R組、Dex-M組(2.3 ng/ml)，每組10只。對照組大鼠在心臟離體平穩(wěn)30 min后，持續(xù)灌注150 min，I/R組、Dex-L組、Dex-M組和右美托咪定-H組大鼠均在心臟離體平穩(wěn)30 min后，停罐30 min，再灌注120 min。離體心臟I/R模型制備：將大鼠以10%水合氯醛進行腹部麻醉后，迅速取出心臟，主動脈插管后，將心臟固定在Langendoff灌流裝置上。常溫下，以含5%CO2和95%O2的K-H溶液進行恒溫恒壓灌流，連通生理信號采集處理系統(tǒng)，心臟穩(wěn)定30 min后，在心肌張力和心率恢復(fù)正常時，停灌30 min，根據(jù)實驗分組進行加藥，灌注120 min。記錄并收集心功能心率(HR)、左心室舒張壓(LVDEP)、冠脈流量(CF)、室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)等指標。

1.2.2心肌組織中炎癥因子和氧化應(yīng)激指標的測定 在灌流結(jié)束后，收集各組大鼠的心肌組織，于4℃下制成勻漿(濃度10%)，離心取上清液，根據(jù)試劑盒操作步驟測定各組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MDA含量及SOD活性。每組重復(fù)檢測3次。

1.2.3心肌組織中NF-κB p65和HO-1蛋白的測定 灌流結(jié)束后，將各組大鼠心肌組織剪碎后，加入蛋白裂解液提取總蛋白，并采用BCA試劑盒檢測其濃度。將蛋白樣品與loading buffer混勻后，置于100℃水浴中變性。將蛋白樣品60 μg滴加到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠孔中，開始以70 V電壓，后改用90 V電壓電泳分離。待電泳結(jié)束后，以250 mA的電流將蛋白樣品轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，再置于含有脫脂奶粉的封閉液中處理2 h。于4℃下加入一抗(NF-κB p65、HO-1和β-actin)反應(yīng)過夜。次日，以封閉液洗滌后，室溫下加入二抗反應(yīng)1 h。洗滌后，于避光條件下，加入電化學(xué)試劑顯色，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，圖像軟件分析各目的蛋白的表達水平。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.4心肌組織中NF-κB p65和HO-1 mRNA的測定 在灌流結(jié)束后，收集各組大鼠的心肌組織，剪碎，以總RNA提取試劑盒提取總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成DNA。將20 μl反應(yīng)體系按照設(shè)定的擴增條件上PCR儀，以β-actin作內(nèi)參，2-△△Ct法測定NF-κB p65和HO-1 mRNA的相對表達水平。擴增條件： 94℃ 預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃ 延伸30 s，32個循環(huán)。β-actin上游引物為5′-GGACCTGACTGACTACC-TC-3′，下游引物為5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。其中NF-κB p65上游引物為5′-CGGGATGGCTACTATGAGGCTGAC-3′，下游引物為5′-GATTCGCTGGCTAATGGCTTGC-T-3′；HO-1上游引物為5′-TCCGATGGGTCCTTACACTC-3′，下游引物為5′-AAGGAAGCCAGCCAAGAGA-3′。

2 結(jié) 果

2.1Dex對心功能的影響 與對照組相比，I/R組中HR、CF、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標均明顯降低，LVDEP指標明顯升高，心功能減弱；在I/R基礎(chǔ)上給予Dex后，HR、CF、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標明顯升高，而LVDEP指標明顯降低，心功能有所改善。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 Dex對心功能的影響

與對照組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05；下表同

2.2Dex對心肌組織中炎癥反應(yīng)的影響 與對照組相比，I/R組和Dex組大鼠心肌組織中IL-6和TNF-α含量均明顯升高，但Dex組中兩種因子的含量又明顯低于I/R組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明Dex明顯改善大鼠離體心臟I/R損傷引起的炎癥反應(yīng)。見表2。

表2 Dex對心肌組織中IL-6、TNF-α含量及SOD活性和MDA含量的影響

2.3Dex對心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 與對照組比較，I/R組和Dex組大鼠心肌組織中SOD活性均明顯降低，而MDA含量均明顯升高；與I/R組相比，Dex組中SOD活性升高，而MDA含量下降。提示Dex明顯改善大鼠離體心臟I/R損傷引起的氧化應(yīng)激損傷，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4Dex對心肌組織中NF-κB p65和HO-1蛋白的影響 與對照組相比，I/R組和Dex組中NF-κB p65和HO-1蛋白的表達水平均明顯升高；Dex組中NF-κB p65的表達水平下降，而HO-1蛋白的表達升高，與I/R組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 Western印跡法檢測結(jié)果

2.5Dex對心肌組織中NF-κB p65和HO-1 mRNA表達的影響 RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織中NF-κB p65和HO-1 mRNA的表達。I/R組和Dex組中NF-κB p65和HO-1 mRNA的表達水平均明顯升高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與I/R組相比，Dex組中NF-κB p65 mRNA的表達水平下降，而HO-1 mRNA的表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中NF-κB p65和HO-1蛋白及mRNA的相對表達量

3 討 論

I/R是影響急性心肌梗死治療的重要因素。HR、LVDEP、CF、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標的改變是反映I/R的重要表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，I/R組和Dex組中HR、CF、-dp/dtmax和-dp/dtmax指標降低，LVDEP指標升高，表明I/R模型構(gòu)建成功。同時，與I/R組相比，Dex組中HR、CF、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標升高，LVDEP指標下降。表明Dex可以改善離體心臟I/R。這一結(jié)果與陳雪君等〔8〕得到Dex后處理能夠改善缺血再灌注左心室功能，減輕心肌缺血再灌注損傷的結(jié)論相吻合。

心肌I/R是一個復(fù)雜的過程，炎癥和氧化應(yīng)激是其形成和發(fā)展的重要機制〔9，10〕。TNF-α是機體受到刺激后，發(fā)揮關(guān)鍵始動作用、激活細胞因子級聯(lián)反應(yīng)的重要物質(zhì)，反映了炎癥反應(yīng)的程度；IL-6是由巨噬細胞、T細胞和單核細胞等產(chǎn)生，反映組織損傷早期情況的物質(zhì)，兩者均在炎癥反應(yīng)中起促進作用，是常用的炎癥檢測指標。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一種具有生物毒性的代謝產(chǎn)物，可反映自由基的損傷程度；SOD是一種具有清除自由基功能的抗氧化酶，可反映機體清除氧自由基的能力；兩者是常用的氧化應(yīng)激指標。張玉輝等〔11〕研究指出，Dex通過抑制促炎因子TNF-α和IL-6的釋放，減輕了心臟瓣膜置換術(shù)患者心肌缺血再灌注引起的損傷。Zeng等〔12〕發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠短暫腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中，Dex可通過下調(diào)MDA、NOX2、TNF-α和IL-6等減弱氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在I/R基礎(chǔ)上，給予Dex處理后，心肌組織中IL-6、TNF-α和MDA含量下降，而SOD活性升高。表明Dex能夠減輕離體心臟缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。

NF-κB是炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控活性氧、炎性因子和細胞因子等的產(chǎn)生和分泌過程中扮演著重要角色〔13〕。HO-1是一種血紅素降解的限速酶，在阻止炎癥過程和氧化性組織損傷中發(fā)揮著重要的保護作用〔14，15〕。Wang等〔16〕指出，Dex可通過抑制NF-κB表達減弱炎癥反應(yīng)，進而發(fā)揮了保護腦缺血/再灌注損傷的作用。王宇恒等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，Dex能夠上調(diào)細胞中HO-1蛋白的表達，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與I/R組相比，Dex組中NF-κB p65蛋白和mRNA的表達下降，而HO-1 蛋白和mRNA的表達升高。提示Dex可能通過下調(diào)NF-κB p65和HO-1表達，抑制離體心臟缺血再灌注損傷過程中的炎癥和氧化應(yīng)激過程。

綜上所述，右美托咪定可減輕離體心臟I/R損傷，其作用機制可能與下調(diào)NF-κB p65炎癥通路及上調(diào)HO-1抗氧化通路，改善心肌組織的炎癥和氧化應(yīng)激水平有關(guān)。這為離體心臟I/R的發(fā)生和發(fā)展提供了新的線索，也為右美托咪定改善離體心臟I/R損傷提供了新的依據(jù)。

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