頸椎病大鼠模型血清IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)及意義

紀(jì)振偉 姚立東 周 杰 夏 力

(武警新疆總隊醫(yī)院軍人病區(qū)骨科，新疆 烏魯木齊 830091)

研究表明〔1〕，頸椎病的致病因素已從過去的自然退變等轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)境因素、生活工作行為因素及體質(zhì)因素。隨著近年來人們生活工作方式的變化，“低頭族”、長期伏案者增多，頸椎病的患病率呈逐年增長的趨勢〔2〕。頸椎病發(fā)病最早期、最本質(zhì)的病理生理改變是頸椎間盤退變，這一改變既表現(xiàn)于頸椎間盤形態(tài)學(xué)上的變化，又表現(xiàn)于頸椎間盤內(nèi)在生物化學(xué)平衡上的變化〔3〕。退變和突出的頸椎間盤內(nèi)存在著多種在頸椎病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)。白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子已被證實可導(dǎo)致椎間盤退變的加劇〔4〕，但目前仍較少見到探討其相關(guān)機制的報道。本研究旨在探討頸椎退變過程中細(xì)胞因子水平的變化及其臨床意義，以期為頸椎病的預(yù)防和治療提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 7個月健康成年雄性SD大鼠45只，體重220～250 g，平均(237.68±8.17)g，由河南省實驗動物中心提供。

1.2建模及分組方法 45只SD大鼠經(jīng)1 w適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采用隨機數(shù)字表法分為實驗組30只和假手術(shù)組15只。頸椎病大鼠模型建立：將大鼠麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺，對頸部皮膚進(jìn)行消毒處理，取頸背部正中切口對皮膚及皮膚下2.0～2.5 cm組織縱向切開，使頸部各肌肉層充分游離后，依次將頸部后側(cè)的肌肉橫向切斷，為防止斷處愈合，切除一段約1.5 cm的部分，然后將大鼠C2～C7椎間盤的棘上韌帶及棘間韌帶依次切斷，最后將皮膚逐層縫合，不拆線，讓其自然脫落。假手術(shù)組組大鼠術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉方法均與實驗組大鼠相同，但取其頸背部正中切口對皮膚及皮膚下2.0～2.5 cm組織縱向切開后即行縫合，不切斷肌肉及韌帶。上述兩組大鼠均在同等正常條件下，置于23℃～25℃的環(huán)境中采用標(biāo)準(zhǔn)飼料單籠喂養(yǎng)。兩組大鼠均于術(shù)后3 d采用5萬U的青霉素鈉肌肉注射抗感染。實驗組有1只大鼠術(shù)后死亡(可能原因為術(shù)中失血過多)，其余大鼠術(shù)后均有扭頭搖晃、低頭等表現(xiàn)，1 w后消失。實驗組另有2只大鼠于術(shù)后1 w死亡(解剖發(fā)現(xiàn)腸脹氣、頸部感染)，其余大鼠均正常。實驗組大鼠經(jīng)頸椎X線檢查發(fā)現(xiàn)椎間孔變小、椎間隙變窄，同時頸椎生理彎曲消失甚至反曲，證實模型建立成功。

根據(jù)細(xì)胞因子監(jiān)測的時間點，再將實驗組大鼠隨機分為1個月組(n=7)、3個月組(n=9)、6個月組(n=11)，假手術(shù)組大鼠隨機分為1個月組(n=5)、3個月組(n=5)、6個月組(n=5)。

1.3檢測指標(biāo) 分別于術(shù)后1、3、6個月對相應(yīng)組別的大鼠再次麻醉，采集腹腔靜脈血后，4℃、3 000 r/min離心15 min，收集上清液并于-80℃條件下保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。ELISA試劑盒購自美國R&D Systems Inc，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件，計量資料兩組間比較采用雙側(cè)t檢驗，三組數(shù)據(jù)比較采用F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清IL-1β檢測結(jié)果 實驗組大鼠各時間段血清IL-1β水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。假手術(shù)組不同時間段血清IL-1β水平整體比較及兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組術(shù)后3個月及6個月血清IL-1β水平明顯低于術(shù)后1個月，同時術(shù)后6個月血清IL-1β水平明顯低于術(shù)后3個月(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血清IL-6、TNF-α檢測結(jié)果 兩組大鼠各時間段血清IL-6、TNF-α水平組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，同時兩組大鼠不同時間段血清IL-6、TNF-α水平組內(nèi)整體比較及兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，表3。

表1 各組大鼠血清IL-1β水平比較

與術(shù)后1個月比較：1)P<0.05；與術(shù)后3個月比較：2)P<0.05

表2 各組大鼠血清IL-6水平比較

表3 各組大鼠血清TNF-α水平比較

3 討 論

隨著生物學(xué)及分子免疫學(xué)的發(fā)展及人們對頸椎病認(rèn)識的深入，退變頸椎間盤組織釋放的多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的作用越來越受到重視。許多證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)既是頸椎間盤退變的產(chǎn)物，又是導(dǎo)致頸椎病各種臨床癥狀產(chǎn)生和加劇的致病因素〔5〕。

IL-1β可誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，并介導(dǎo)了單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤和聚集，是ILs家族中介導(dǎo)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)最重要的一員〔6〕。可認(rèn)為IL-1β是一個潛在的始動因素，對椎間盤退變的過程中的多個環(huán)節(jié)存在影響，既可以通過誘導(dǎo)一氧化氮及金屬蛋白酶使髓核中的蛋白聚糖分解加劇而使合成受到抑制，導(dǎo)致蛋白聚糖丟失從而直接影響椎間盤退變，也可通過影響其他炎性介質(zhì)間接影響椎間盤退變繼發(fā)性病理過程〔7〕。本研究結(jié)果表明IL-1β在頸椎退變中發(fā)揮著重要作用。頸椎退變過程中局部IL-1β的高表達(dá)介導(dǎo)了強大的炎性反應(yīng)，而當(dāng)炎性反應(yīng)在局部加劇時，椎間盤細(xì)胞基質(zhì)的降解及細(xì)胞氧化速度也隨之加快，從而又促進(jìn)了椎間盤的退變。陳巖等〔8〕研究不同劑量川芎嗪對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤終板軟骨細(xì)胞退變的影響，發(fā)現(xiàn)6.25～25.00 μmol/L的川芎嗪可抑制IL-1β的表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤終板軟骨細(xì)胞退變。這一結(jié)論提示了消除局部炎癥因子、恢復(fù)椎間盤內(nèi)各種細(xì)胞因子的正常表達(dá)或可治療頸椎間盤退變，但后續(xù)仍需大量的動物實驗進(jìn)行驗證。

IL-6是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，對細(xì)胞生長、分化乃至基因表達(dá)均有一定的影響。有研究表明〔9〕，IL-6在退行性關(guān)節(jié)病發(fā)病中作為炎性遞質(zhì)有著重要的作用。在椎間盤蛻變的炎癥過程中，IL-6可促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集并促使炎性遞質(zhì)釋放，其效果相當(dāng)于炎癥的促進(jìn)劑〔10〕。Deng等〔11〕觀察到頸椎間盤突出患者血清IL-6水平有明顯的上調(diào)。而本研究各時間點兩組大鼠血清IL-6水平均無顯著變化，原因可能是由于本研究選擇的檢測時間點與之有差異。Li等〔12〕認(rèn)為，退變中的椎間盤自身仍存在一定的內(nèi)源性修復(fù)潛力，筆者認(rèn)為研究結(jié)果的差異可能也與其相關(guān)。漆啟華等〔13〕發(fā)現(xiàn)大鼠退變椎間盤組織中的IL-6在造模成功16 w內(nèi)均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示本研究結(jié)果與前人存在差異的另一個原因可能是大鼠血清中炎性因子的含量顯著低于椎間盤組織中炎性因子的含量。

TNF-α具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，在細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮起始作用，可誘發(fā)自身和其他細(xì)胞因子釋放，從而導(dǎo)致機體損傷。TNF-α的許多損傷作用需要依靠其他因素產(chǎn)生，研究表明〔14,15〕，其在椎間盤退變的過程中，可降低椎間盤基質(zhì)降解酶的活性，并對炎癥反應(yīng)起到促進(jìn)作用，導(dǎo)致髓核脫水、彈性減弱，使椎間盤力學(xué)性能受到改變，從而引發(fā)退變。本研究中兩組大鼠血清中TNF-α在各時間點均無明顯差異，而田園等〔16〕的研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)大鼠相比較，頸椎病大鼠組織中TNF-α存在高表達(dá)，提示椎間盤退變多通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生細(xì)胞因子，不會引起血液中細(xì)胞因子的濃度升高，而僅在退變的椎間盤局部產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)。

綜上所述，頸椎退變過程中可能伴隨著血清IL-1β水平升高，但血清IL-6、TNF-α水平并無明顯改變。同時本研究中實驗組大鼠術(shù)后血清IL-1β水平隨時間的變化呈現(xiàn)下降的趨勢，推測與其頸部肌肉瘀痕逐漸愈合而使頸椎的動靜力平衡得到部分恢復(fù)有關(guān)，但其具體的作用機制仍有待進(jìn)一步的實驗研究。

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