山茱萸多糖對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶及海馬糖原合成酶激酶-3β表達的影響

蘇亞楠 程 開 竇鵬揮 陳立強 王 禹

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為嚴重的記憶和認知功能減退，且伴有多種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。近年來，藥物治療主要有影響神經(jīng)遞質(zhì)的藥物，作用于β淀粉樣蛋白(Aβ)的藥物，作用于tau蛋白的藥物，神經(jīng)保護藥物等方面。目前美國FDA批準的臨床藥物有膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑〔1〕，這些藥物雖能緩解癥狀或在一定程度上改善患者的行為和認知能力，但療效有限，不能治愈或完全阻止疾病發(fā)展。因此研究開發(fā)有效預防AD疾病發(fā)生及延緩病情發(fā)展的藥物已成為當前新藥研發(fā)的重要目標。本實驗研究山茱萸多糖對AD模型大鼠學習記憶能力改變、糖原合成酶激酶(GSK)-3β蛋白表達的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物和分組 Wistar大鼠80只，清潔級，飼養(yǎng)室溫為20℃，自由進食飲水，自然晝夜節(jié)律光照，3月齡，體重(135.4±10.7)g。隨機分為4組：青年組、模型組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組。

1.2主要試劑 兔抗-GSK-3β(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；電化學發(fā)光底物(ECL)試劑盒、免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；Aβ1～40購自無錫亞肽生物科技有限公司；多奈哌齊購自法國PFIZER PGM公司；山茱萸多糖提取物(4∶1)購自朗林生物制品有限公司。

1.3模型制備和給藥 將白色干粉Aβ1～40溶于無菌生理鹽水中，配置成濃度為10 μg/μl Aβ1～40溶液，用前1 w放置于37℃溫箱中孵育，使其凝聚老化。大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后，參照文獻〔2〕配制1.25%的D-半乳糖溶液，以100 mg·kg-1·d-1的劑量進行腹腔注射，連續(xù)6 w，施行Aβ1～40海馬注射。大鼠稱重后，10%水合氯醛麻醉，380 mg/kg腹腔注射；麻醉后將模型組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組大鼠固定于腦立體定位儀上，于頭頂局部備皮、消毒，正中矢狀線切開約1.5 cm，清晰暴露前囟。參照文獻〔3〕，前后囟確定在同一水平線上，于前囟后3.72 mm、中線旁開2.0 mm處鉆一直徑約0.6 mm的孔。用微量注射器取Aβ1～402 μl，進針至硬腦膜下約3 mm，以1 μl/min的速度均勻注入凝聚態(tài) Aβ1～40溶液2 μl，2 min注射畢后，留針10 min后緩慢退出。用酒精消毒并縫合皮膚，將大鼠置于空籠內(nèi)待其蘇醒。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素10萬U預防感染。術(shù)后7 d，模型組、青年組以等量生理鹽水灌胃，多奈哌齊組以0.5 mg·kg-1·d-1灌胃，山茱萸多糖組以0.175 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)30 d，1次/d。

1.4Morris水迷宮檢測 大鼠適應性喂養(yǎng)1 w、造模8 d、藥物灌胃30 d各組大鼠進行實驗。主要測試大鼠被動空間學習及記憶能力，包括定位航行試驗及空間探索試驗，測試時間是6 d。①定位航行試驗：測試時間是5 d。實驗前將大鼠頭頸部涂成黃色，有利于圖像的跟蹤采集；可視平臺放置于某一象限的中心及備好實驗用水，水溫(25±1)℃等。實驗分成上下午兩階段，每階段訓練4次，依次以水池的4個象限為大鼠入水點讓大鼠面向池壁。大鼠游泳至找到水下的平臺為止，如果大鼠在2 min之內(nèi)找到平臺，讓其在平臺停留0.5 min；如果大鼠在水池內(nèi)游泳至2 min后未找到平臺，將大鼠引致平臺，讓其在平臺上停留0.5 min，達到加強記憶的作用。在大鼠每次訓練后注意保溫，休息1 min進行下面的訓練。記錄每次大鼠訓練尋找平臺的軌跡圖，4個不同象限的平均值是該次逃避潛伏期。②空間探索試驗：用于檢測大鼠的空間記憶能力。實驗第6天撤除平臺，將大鼠隨機任選一個入水點放入水中，記錄大鼠在2 min內(nèi)在原平臺所在象限的停留時間及穿越原平臺位置的次數(shù)。

1.5取材和檢測 大鼠藥物干預30 d后，將實驗大鼠用乙醚(1～2滴/鼠，5 min左右)深麻醉后固定于木板上，快速剪開胸骨，將灌注針沿左心室插入主動脈，固定針頭，剪開右心耳放血，用溫0.9%生理鹽水沖洗殘余血液，至四肢蒼白為止；換上4%多聚甲醛溶液進行心臟灌注固定腦組織，先快后慢，直到大鼠全身僵硬。斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，4℃冰箱保存。于大鼠腦組織海馬處取材，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片，片厚5 μm，40℃水浴中展片，用經(jīng)多聚賴氨酸0.1 mg/ml防脫片處理過的載玻片撈片，置于60℃烤箱烘烤1 h后進行常規(guī)HE染色和免疫組織化學法，檢測海馬GSK-3β蛋白的表達。圖像采集用Image-Pro Plus6.0分析軟件計算陽性染色的平均光密度值。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD(L)和S-N-K(S)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組定位航行試驗結(jié)果比較 干預前與青年組比較，模型組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組大鼠逃避潛伏時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；干預后青年組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組與模型組比較明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。多奈哌齊組、山茱萸多糖組大鼠逃避潛伏時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組干預前、后平均逃避潛伏期

與青年組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

2.2各組空間探索能力比較 造模后，模型組、多奈哌齊組及山茱萸多糖組穿越原平臺次數(shù)明顯少于青年組(P<0.05)；藥物干預后與模型組比較，多奈哌齊組、山茱萸多糖組穿越原平臺次數(shù)均明顯增加(P<0.05)；多奈哌齊組、山茱萸多糖組大鼠穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3組織病理學觀察 在海馬CA2區(qū)，與青年組比較，模型組CA2區(qū)神經(jīng)元顯著丟失，錐形細胞呈松散排列，山茱萸多糖組、多奈哌齊組與模型組比較海馬組

織病理學顯著改善，見圖1。

表2 各組干預前、后2 min內(nèi)穿越原平臺次數(shù)次，n=20)

圖1 各組大鼠海馬組織病理學觀察(HE，×400)

2.4各組海馬GSK-3β表達 在海馬CA2區(qū)，模型組海馬GSK-3β蛋白表達(0.506±0.064)明顯高于青年組(0.235±0.028，P<0.05)；與模型組比較，山茱萸多糖組(0.405±0.058)，多奈哌齊組(0.418±0.041)GSK-3β蛋白表達明顯減弱(P<0.05)。而山茱萸多糖組與多奈哌齊組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 大鼠海馬CA2區(qū)GSK-3β蛋白表達(DAB，×400)

3 討 論

AD早期特征性病理損害兩大主要特征是神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)〔4〕和細胞外Aβ聚集導致老年斑(SP)形成〔5，6〕。雙股螺旋纖維(PHF)是NFTs的主要成分，導致這兩種病理改變的最重要原因是tau蛋白的過度磷酸化。tau蛋白是神經(jīng)細胞中含量最高的微管相關(guān)蛋白，對促進微管的形成和維持微管穩(wěn)定性有著非常重要的作用。tau蛋白被過度磷酸化，即喪失了促進微管組裝的生物學活性，也具有神經(jīng)毒性〔7〕。有實驗表明〔8〕，AD患者的臨床癡呆程度僅與NFTs的數(shù)量密切相關(guān)。AD中tau蛋白的異常過度磷酸化被認為是AD致病的關(guān)鍵因素。tau蛋白過度磷酸化主要受到蛋白激酶活性與磷酸酯酶活性的調(diào)控，對tau蛋白磷酸化起主要調(diào)節(jié)作用的是GSK-3β〔9〕。AD患者腦中，在有纏結(jié)的神經(jīng)元中可以檢測到大量活性形式的GSK-3β的聚集，提示GSK-3β可能與過度磷酸化的tau蛋白直接相關(guān)，而抑制GSK-3β活性水平可顯著改善多種因素誘導的tau過度磷酸化及動物認知障礙〔10〕。GSK-3β可使tau多個AD相關(guān)位點發(fā)生過度磷酸化，同時GSK-3β還能增加Aβ的神經(jīng)毒性，進一步增加神經(jīng)纖維纏結(jié)〔10〕。所以調(diào)節(jié)GSK-3β和磷酸化GSK-3β的活性是減輕AD早期病理改變的重要手段之一。研究也證實〔11〕，體內(nèi)GSK-3β含量變化與AD病理進展程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果說明山茱萸多糖對AD大鼠學習記憶能力起到良好改善作用，間接證明對海馬區(qū)的功能有保護和修復作用。

山茱萸是中醫(yī)名貴藥材之一，是山茱萸的干燥果肉，又名山萸肉、肉棗等，其味酸、澀、微溫，是我國的傳統(tǒng)中藥材。《本草綱目》載：山茱萸，主治心下邪氣寒熱，溫中，逐寒溫痹，去三蟲，久服輕身；有強陰益精、安五臟、通九竅、止小便淋瀝之功；久服明目、強力長年〔12〕?，F(xiàn)代化學分析方法證實山茱萸的化學成分包括山茱萸甙、環(huán)烯醚萜苷、五環(huán)三萜酸、酒石酸、鞣質(zhì)、多糖類、蘋果酸和多種維生素等〔13〕。現(xiàn)已明確山茱萸多糖主要成分是PFCC、PFCAⅢ、SZYP-2、Co-4等〔14〕，是山茱萸的生物學活性物質(zhì)重要成分，有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強免疫功能、抗衰老、降低血糖血脂保護心腦血管系統(tǒng)等重要的藥理作用。

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