紫莖澤蘭提取物對3種雜草的化感脅迫作用

馬金虎,楊文秀,孫亮亮,陳 皓,趙 倩,楊小環(huán),*

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,太谷 030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,太谷 030801 3 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院,普洱 665000

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)為多年生、叢生狀常綠半灌木植物,是一種世界性惡性雜草,生活力強、化感作用強烈[1- 3]。紫莖澤蘭植株中富含天然活性物質(zhì),其提取物對多種植物具有強烈的化感作用,顯著抑制植物的生長發(fā)育,有望被開發(fā)成植物源除草劑應(yīng)用于雜草的綠色防控。鄭麗等[4]報道,2.5%的紫莖澤蘭葉片水提取液顯著的抑制細(xì)葉苦荬、莎草磚子苗、無芒虎尾草、紫花大翼豆、白三葉等種子萌發(fā)和幼苗生長。王亞麒等[5]報道,100 mg/L的紫莖澤蘭浸提液對白三葉、黑麥草和紫花苜蓿種子發(fā)芽和幼苗生長均有顯著的抑制作用。

稗草(Echinochloacrusgalli)、灰綠藜(Chenopodiumglaucum)和反枝莧(Amaranthusretroflexus)分別是禾本科、藜科和莧科雜草中分布最廣,危害最為嚴(yán)重的雜草,廣泛分布于全國各地,常以優(yōu)勢草種生于農(nóng)田,危害農(nóng)作物的生長,特別是稗草,2012年來在我國已經(jīng)上升為水稻產(chǎn)區(qū)第一惡性雜草,影響水稻的產(chǎn)量及品質(zhì)。多年來,對這3種雜草的防除,多采用人工拔除和使用化學(xué)除草劑的方法,不僅耗費大量的人力且大量使用化學(xué)除草劑除對生態(tài)環(huán)境也造成了一定的破壞[6-7]。作者前期研究發(fā)現(xiàn),紫莖澤蘭提取物對反枝莧和灰綠藜種子萌發(fā)和幼苗生長有顯著地抑制作用,對幼苗活性氧代謝水平有明顯的影響[8]。但是,紫莖澤蘭提取物抑制兩種雜草的細(xì)胞生理機制還不清楚,紫莖澤蘭提取物對稗草是否也有化感作用未見報道。為此,本試驗以上述3種主要的田間雜草為研究對象,重點從細(xì)胞生理學(xué)角度,研究了紫莖澤蘭提取物對3種雜草幼苗根和根邊緣細(xì)胞化感作用的影響,旨在明確紫莖澤蘭提取物對3種雜草化感脅迫的生理機制,為紫莖澤蘭提取物開發(fā)成植物源除草劑應(yīng)用于3種雜草綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫莖澤蘭提取物的制備方法：采集紫莖澤蘭成熟葉,室溫下陰干,粉碎機粉碎,過40目篩,用95%的乙醇浸泡72 h提取3次。浸提液用砂芯抽濾器(微孔濾膜孔徑為0.45 μm)過濾,合并浸提液。浸提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器經(jīng)減壓濃縮除去大部分乙醇,得到濃稠的提取物。將提取物溶于適量水中制成混懸液,然后用石油醚進(jìn)行萃取,共萃取5次。萃取物再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器經(jīng)減壓濃縮后,置低溫真空干燥箱中揮發(fā)掉石油醚得到紫莖澤蘭提取物,4℃低溫下避光保存?zhèn)溆?。在使用時,稱適量紫莖澤蘭提取物,先用少量丙酮溶解(每克提取物5 mL丙酮),再配制成不同濃度的提取物水溶液。

供試雜草稗草(Echinochloacrusgalli)、灰綠藜(Chenopodiumglaucum)和反枝莧(Amaranthusretroflexus)的種子均收集于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站。

1.2 材料培養(yǎng)和紫莖澤蘭提取物處理

挑選均勻飽滿的3種雜草種子適量,用0.1% HgCl2消毒5 min,然后用蒸餾水洗去HgCl2殘液,再用濾紙吸干種子表面水分。采用紙卷發(fā)芽的方法,反枝莧和灰綠藜分別取100粒、稗草取50粒種子均勻擺放在18 cm×25 cm濾紙的中上部,蓋上同等大小的濾紙,小心將濾紙卷成紙卷。每4個紙卷用橡皮筋扎為一組(4次重復(fù)),置于300 mL燒杯中,進(jìn)行不同濃度的提取物處理(Extracts treatment,ET),并以蒸餾水處理作為對照。實踐中發(fā)現(xiàn),3種雜草種子對ET溶液的脅迫敏感程度不同,尤其是反枝莧,經(jīng)濃度高于600 mg/L ET處理4天后,有爛苗現(xiàn)象。為便于統(tǒng)計3種雜草種子萌發(fā)指標(biāo),設(shè)定稗草和灰綠藜種子的ET濃度為250、500、750 mg/L和1000 mg/L,而反枝莧種子的ET濃度為150、300、450 mg/L和600 mg/L。將燒杯置于25℃培養(yǎng)箱中,黑暗下進(jìn)行種子發(fā)芽試驗,每天統(tǒng)計種子的各項發(fā)芽指標(biāo),種子萌發(fā)生長8 d結(jié)束試驗。此外,按照相同的方法進(jìn)行種子萌發(fā),設(shè)置對照和一個較高濃度的ET(1000 mg/L)對3種雜草種子進(jìn)行處理,種子萌發(fā)生長至4 d時,取活的幼苗根尖用于根尖電鏡掃描樣品的制作。

將消毒的雙層紗布用橡皮筋固定在500 mL燒杯口上,然后每個雜草品種取200粒消毒的種子置于紗布上,再在種子上覆蓋一層濾紙和一層脫脂棉。在脫脂棉上分別均勻滴加15 mL蒸餾水(作為對照)或500、750 mg/L和1000 mg/L的ET,再用保鮮膜封閉。將燒杯置25℃培養(yǎng)箱內(nèi),進(jìn)行幼苗根懸空培養(yǎng)。待3種雜草對照的幼苗根長約20 mm時,進(jìn)行如下處理：(1)不同雜草每處理挑選50個均勻一致的根尖制備根邊緣細(xì)胞懸液,用于測定根邊緣細(xì)胞(RBC)數(shù)、活率、凋亡率、黏膠層厚度。(2)不同雜草每處理分別取5個根尖,用刀片切取約10 mm長的根尖用于根尖和根尖原位邊緣細(xì)胞的顯微觀察拍照。

同上述幼苗根懸空培養(yǎng)方法,進(jìn)行3種雜草根懸空培養(yǎng)(不進(jìn)行ET脅迫),待雜草幼苗根生長至約5 mm時,對雜草根尖每隔1 h噴施蒸餾水(作為對照)或500、750 mg/L和1000 mg/L的ET,連續(xù)噴施5次,再生長12 h后切取幼苗根尖,測定其根冠果膠甲基酯酶(PME)活性。

1.3 測定指標(biāo)與方法

不同雜草種子發(fā)芽和幼苗生長指標(biāo)的統(tǒng)計 按種子檢驗規(guī)程[9]統(tǒng)計各處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(G)=Ga/Gn×100%(Ga：3d發(fā)芽種子數(shù)；Gn：供試種子數(shù))、發(fā)芽指數(shù)(GI)= Σ(Gt·Dt-1)(Gt：td 內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)；Dt：發(fā)芽天數(shù))、種子活力指數(shù)(VI)=GI×W(W：單株幼苗平均鮮重)、莖長抑制率=(對照莖長-處理莖長)/對照莖長、根長抑制率=(對照根長-處理根長)/對照根長、幼苗鮮重。其中,莖長抑制率、根長抑制率、幼苗鮮重每處理取20株幼苗取平均值。每處理重復(fù)4次。

因為n≥6,n-k≥3,根據(jù)性質(zhì)1,|Ei,j|≥2,取邊且邊(x,y),(x′,y′)∈Ei,j,則在內(nèi)存在x與x′間的哈密頓路HP,不妨令HP={x,P1,u,P2,x′}.同理,在內(nèi)存在y與y′間的哈密頓路HP′,取HP′={y,Q1,v,Q2,y′}.下面構(gòu)造u,v間內(nèi)不交的路.

根尖電鏡掃描樣品的制作與觀察 參照范華等[10]的方法：切取對照和1000 mg/L ET溶液脅迫處理的根尖大約10 mm,迅速放到3%戊二醛固定液中,0—4℃下固定2 d。用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L, pH=7.2)洗滌3次,每次15 min,依次用30%,50%,70%,80%,90%和95%的乙醇系列脫水(每一梯度脫水15 min),100%的乙醇脫水兩次,每次20 min,之后叔丁醇置換。樣品用JEOL JFD- 320冷凍干燥,將干燥好的材料用導(dǎo)電膠帶粘在樣品臺上,用JEOL JFC- 1600離子濺射鍍膜儀噴鍍鉑金,噴鍍好的材料放入JEOL JEM- 6490 LV掃描電子顯微鏡下觀察拍照。

根邊緣細(xì)胞(RBC)活性測定及根尖邊緣細(xì)胞原位觀察 RBC活性測定參考胡忠良等[11]的方法。不同雜草,每處理挑選50個均勻一致的根尖,切取5 mm將其浸泡在盛有200 μL蒸餾水的離心管中,振蕩器振蕩30 s,取出根尖再用50 μL的蒸餾水沖洗兩次。收集細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入微量注射器(規(guī)格1000 μL)擠壓3次,使成團的邊緣細(xì)胞分離開。將細(xì)胞懸液4 ℃下 500 r/min離心3 min,棄去部分上清液,獲得細(xì)胞分散均勻、濃度適宜的細(xì)胞懸液備用。取50 μL RBC懸浮液,加入20 μL AO-EB復(fù)合染液(AO∶EB= 1∶1),充分混勻,避光染色1 min。取少許懸液,加入血細(xì)胞計數(shù)板,在Olympus BX 53(U-RFL-T)熒光顯微鏡(藍(lán)色激發(fā)光)下觀察記錄根邊緣細(xì)胞總數(shù),活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量(活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,死細(xì)胞呈橘紅色或紅色熒光)。細(xì)胞活率=(活細(xì)胞數(shù)/總數(shù)細(xì)胞)×100%。每處理重復(fù)5次；每處理切取5個根尖置載玻片上,滴加少量AO-EB復(fù)合染液立即在顯微鏡下觀察拍照。

RBC 凋亡率的測定 取50 μL備用的細(xì)胞懸液,加入75 μL Hochest- 33258染液,暗處染色5 min,吸取少量懸液,加入血細(xì)胞計數(shù)板,在紫外UV激發(fā)光下觀察活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征并計數(shù)[12]。

RBC 黏膠層厚度的測定 取50 μL備用的細(xì)胞懸液,與50 μL的墨水(India ink)混勻染色5 min,取少量混合液滴在載玻片上,蓋片,在熒光顯微鏡下觀察測量。RBC的黏膠層厚度測量,不同處理測定10個細(xì)胞,每個細(xì)胞測3個不同位置取其平均值[13-14]。

根冠果膠甲基酯酶(PME)活性測定 參照胡忠良等[11]的方法。不同雜草,隨機剪取不同處理長約5 mm的根尖30個,加入400 μL PME提取液(內(nèi)含0.2 mol/L Na2HPO4, 0.1 mol/L檸檬酸,1 mol/L NaCl, pH=5.8),冰浴研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中,再用400 μL PME提取液清洗研缽1次,合并入離心管中,置于4℃冰箱中,每隔20 min振蕩1次,1 h后,4℃ 15000 r/min離心10 min。取300 μL酶液加入4 mL PME底物溶液(內(nèi)含0.5% w/v果膠,0.05% w/v甲基紅,0.2 mol/L NaCl,pH=6.8),37℃水浴2 h,525 nm波長下測定OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PME活性,活性單位為μmol H+/根尖數(shù)/h。每處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均采用DPS 6.5軟件處理,采用Duncan新復(fù)極差測驗法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(P< 0.05)。利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖,Adobe Photoshop CS5輔助圖片整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度紫莖澤蘭提取物對3種雜草種子萌發(fā)生長的影響

圖1試驗結(jié)果表明,750 mg/L以上濃度的紫莖澤蘭提取物脅迫顯著地抑制稗草種子的萌發(fā)生長。750 mg/L提取物脅迫處理與其對照比,種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)和幼苗鮮重分別降低了24.7%、6.8%、29.4%和31.2%,幼苗莖長抑制率和根長抑制率分別達(dá)到44.0%和80.8%；250 mg/L以上濃度提取物脅迫顯著地抑制灰綠藜種子的萌發(fā)生長。250 mg/L提取物脅迫處理與其對照比種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和幼苗鮮重分別降低了32.5%、20.7%、23.3%、30.2%和5.1%,幼苗莖長抑制率和根長抑制率分別達(dá)到12.7%和60.8%；150 mg/L以上濃度提取物脅迫顯著地抑制反枝莧種子的萌發(fā)生長。150 mg/L提取物脅迫處理與其對照比種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別降低了34.8%和20.2%,幼苗莖長抑制率和根長抑制率分別達(dá)到7.8%和23.4%；從圖1試驗結(jié)果綜合分析,3種雜草對紫莖澤蘭提取物脅迫的敏感程度反枝莧>灰綠藜>稗草。

圖1 不同濃度紫莖澤蘭提取物對雜草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響Fig.1 Effects of Eupatorium adenophorum extracts of different concentrations on seed germination and seedlings growth of weeds同一品種不同字母表示處理間差異顯著(P < 0.05),下同；ET：提取物處理,Extracts treatment；P1：稗草,Echinochloa crusgalli；P2：灰綠藜,Chenopodium glaucum；P3：反枝莧,Amaranthus retroflexus

2.2 紫莖澤蘭提取物對3種雜草根尖和根邊緣細(xì)胞脅迫傷害的形態(tài)觀察

光學(xué)顯微鏡下(圖3),3種雜草對照幼苗根尖均可清晰地觀察到根尖周圍附著大量活的邊緣細(xì)胞,根尖結(jié)構(gòu)完整且保持生活力。1000 mg/L紫莖澤蘭提取物處理,3種雜草根尖組織和細(xì)胞以及根邊緣細(xì)胞大量被殺死,根邊緣細(xì)胞數(shù)量減少。

圖2 稗草、灰綠藜和反枝莧根尖和根邊緣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological features of root tips and border cells in Echinochloa crusgalli, Chenopodium glaucum and Amaranthus retroflexu revealed by SEM

圖3 熒光顯微鏡下稗草、灰綠藜和反枝莧根尖和根邊緣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphological features of root tips and border cells in Echinochloa crusgalli, Chenopodium glaucum and Amaranthus retroflexu under the fluorescent microscope綠色為活的組織和細(xì)胞,紅色和橘紅色為死的組織和細(xì)胞

2.3 不同濃度紫莖澤蘭提取物脅迫對3種雜草根邊緣細(xì)胞數(shù)量和活率的影響

光學(xué)顯微鏡下,稗草根邊緣細(xì)胞的形態(tài)大部分呈現(xiàn)梭形、橢圓形或桿狀,細(xì)胞較小?；揖G藜、反枝莧根邊緣細(xì)胞多數(shù)呈桿形、月牙形或弧形,細(xì)胞普遍較大。3種雜草活細(xì)胞均呈綠色,死細(xì)胞為紅色和橘紅色(圖4)。

試驗結(jié)果表明(圖5),紫莖澤蘭提取物處理顯著抑制3種雜草RBC的數(shù)量,提取物濃度越高抑制作用越強烈。1000 mg/L提取物處理,稗草、灰綠藜、反枝莧RBC數(shù)比其對照分別降低了44.5%、48.3%和64.0%(圖4A)；提取物處理還顯著抑制3種雜草RBC的活率。1000 mg/L提取物處理,稗草、灰綠藜和反枝莧的RBC活率分別比其對照降低了92.2%、62.4%和78.6%(圖4B)。

圖4 AO-EB 染色的稗草(A)、灰綠藜(B)和反枝莧(C) RBCFig.4 AO-EB stained RBCs of Echinochloa crusgalli (A), Chenopodium glaucum (B) and Amaranthus retroflexu (C)綠色：活細(xì)胞；紅色和橘紅色：死細(xì)胞

圖5 紫莖澤蘭提取物對稗草、灰綠藜和反枝莧根系邊緣細(xì)胞(RBC)數(shù)量和活率的影響Fig.5 Effects of Eupatorium adenophorum extracts on the numbers and motilities of RBC in Echinochloa crusgalli, Chenopodium glaucum and Amaranthus retroflexu

2.4 不同濃度紫莖澤蘭提取物脅迫對3種雜草根邊緣細(xì)胞凋亡率的影響

圖6可見,Hoechest- 33258 染色的3種雜草正常根尖RBC顏色呈藍(lán)色且質(zhì)地均勻一致,細(xì)胞核輪廓清晰且呈現(xiàn)較小的藍(lán)色亮斑；出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的RBC顏色不均勻,細(xì)胞有片狀淺藍(lán)色片段或細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散狀輪廓不規(guī)則較大的亮斑。

從圖7可以看出,紫莖澤蘭提取物處理,隨提取物濃度的升高,3種雜草RBC的凋亡率均逐漸增大。500 mg/L提取物處理,反枝莧、灰綠藜、稗草RBC凋亡率分別比其對照升高了115.5%、83.6%和26.7%。1000 mg/L提取物處理,反枝莧、灰綠藜和稗草RBC凋亡率分別達(dá)97.1%、91.3%和81.7%。說明,反枝莧RBC對提取物脅迫的耐性相對較弱。

圖6 Hoechest- 33258 染色的稗草(A)、灰綠藜(B)和反枝莧(C)的根系邊緣細(xì)胞(RBC)Fig.6 Hoechest- 33258 stained RBCs of Echinochloa crusgalli (A), Chenopodium glaucum (B) and Amaranthus retroflexu (C)1：正常的 RBC；2：出現(xiàn)凋亡片段的 RBC

圖7 不同濃度紫莖澤蘭提取物對稗草、灰綠藜和反枝莧根系邊緣細(xì)胞(RBC)凋亡率的影響Fig.7 Effects of Eupatorium adenophorum extracts of different concentrations on the apoptosis rates of RBC in Echinochloa crusgalli, Chenopodium glaucum and Amaranthus retroflexu

2.5 不同濃度紫莖澤蘭提取物脅迫對3種雜草根邊緣細(xì)胞黏膠層厚度的影響

從圖8和圖9可知,隨提取物濃度的升高,3種雜草RBC的黏膠層厚度均逐漸增大。500 mg/L提取物處理,稗草、灰綠藜和反枝莧RBC的黏膠層厚度比其對照分別增加了26.7%、17.4%和20.1%,均達(dá)到顯著差異。1000 mg/L提取物處理,稗草、灰綠藜和反枝莧RBC的黏膠層厚度比其對照比分別增加了99.0%、65.5%和61.1%。說明,紫莖澤蘭提取物誘導(dǎo)雜草RBC黏膠層增厚。

2.6 不同濃度紫莖澤蘭提取物脅迫對3種雜草根冠果膠甲基酯酶(PME)活性的影響

從圖10可以看出,750 mg/L和1000 mg/L提取物處理,反枝莧PME活性與其對照比分別升高了4.7%和6.1%,均達(dá)到顯著差異。1000 mg/L提取物處理,灰綠藜PME活性與其對照比升高了5.6%,也達(dá)到顯著差異。而稗草經(jīng)500、750 mg/L和1000 mg/L提取物脅迫處理,PME活性與其對照比無明顯變化。這可能與其相對耐提取物脅迫有關(guān)。

3 討論

細(xì)胞毒性是化感物質(zhì)作用的一個重要特性[15],化感物質(zhì)與受體植物細(xì)胞表面相互作用,破壞細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu),干擾細(xì)胞有絲分裂和基因表達(dá),導(dǎo)致受體植物生長發(fā)育受阻[15- 17]。從本研究結(jié)果看,隨著紫莖澤蘭提取物處理濃度的升高,3種雜草的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等逐漸降低,幼苗的莖長抑制率、根長抑制率增大,幼苗鮮重降低。這一結(jié)果說明,紫莖澤蘭提取物對3種雜草種子萌發(fā)生長產(chǎn)生細(xì)胞毒性,從而抑制種子的萌發(fā)和幼苗生長。Yang等[18]曾報道,紫莖澤蘭主效化感物質(zhì)DTD(澤蘭二酮)和HHO(羥基澤蘭酮)導(dǎo)致水稻根尖組織混亂,細(xì)胞萎縮。本研究中較高濃度的紫莖澤蘭提取物處理使稗草根尖發(fā)生腫脹變形,灰綠藜根尖抽縮、干癟,反枝莧根尖組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重被破壞,根尖表層細(xì)胞脫落,內(nèi)層細(xì)胞排列混亂(圖2),與其結(jié)果相類似。因此推測,試驗中使用的紫莖澤蘭提取物中可能含有DTD和HHO這兩種物質(zhì),有待對提取物進(jìn)行進(jìn)一步的分離、純化和鑒定并加以證實。

根邊緣細(xì)胞是從根冠表面脫落下來并聚集在根部周圍的一群特化細(xì)胞,以前人們普遍認(rèn)為RBC沒有活性[19]。然而進(jìn)一步的研究表明,多種植物的RBC脫離母體前的存活率超過90%[20]。本研究發(fā)現(xiàn),3種雜草稗草、灰綠藜和反枝莧的RBC的數(shù)量和活率存在品種差異,與Cai等[13]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)相一致。稗草的RBC數(shù)量和脫離根尖后的活細(xì)胞較多,而灰綠藜和反枝莧較少,這可能是由于稗草、灰綠藜和反枝莧分屬不同的科屬原因所致,與其物種自身的特性有關(guān)。

圖8 紫莖澤蘭提取物處理后稗草、灰綠藜和反枝莧根系邊緣細(xì)胞(RBC)的黏膠層Fig.8 The mucilage glue layer around RBCs in Echinochloa crusgalli, Chenopodium glaucum and Amaranthus retroflexu subjected to treatment with Eupatorium adenophorum extracts箭頭所指為黏膠層

化感脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,當(dāng)受到某些高毒性的化感物質(zhì)脅迫時,受體植物細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征,如細(xì)胞核出現(xiàn)彌散現(xiàn)象等[21],嚴(yán)重時可以引起細(xì)胞的死亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn),紫莖澤蘭提取物脅迫,3種雜草根邊緣細(xì)胞Hoechest- 33258染色后部分細(xì)胞有的顏色不均勻,細(xì)胞有片狀淺藍(lán)色片段,有的細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)不規(guī)則較大的亮斑,出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。說明,提取物脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,最終引起細(xì)胞死亡。從3種雜草的根邊緣細(xì)胞AO-EB染色發(fā)現(xiàn),隨提取物濃度的升高,3種雜草的根邊緣細(xì)胞呈現(xiàn)紅色或橘黃色細(xì)胞的數(shù)量在增多,這也直接證明了提取物脅迫,降低了根邊緣細(xì)胞活率的試驗現(xiàn)象。

圖9 紫莖澤蘭提取物對稗草、灰綠藜和反枝莧根系邊緣細(xì)胞(RBC)黏膠層厚度的影響Fig.9 Effects of Eupatorium adenophorum extracts on the thickness of RBC mucilage glue layers in Echinochloa crusgalli, Chenopodium glaucum, and Amaranthus retroflexu

圖10 紫莖澤蘭提取物對稗草、灰綠藜和反枝莧根冠PME活性的影響Fig.10 Effects of Eupatorium adenophorum extracts on the PME activities of root caps in Echinochloa crusgalli, Chenopodium glaucum and Amaranthus retroflexu

當(dāng)植物根遭到有毒物質(zhì)和微生物脅迫時,根系邊緣細(xì)胞保護植物根尖抵御外界有毒物質(zhì)和微生物的危害[22]。根邊緣細(xì)胞從根尖分離后自主進(jìn)行新陳代謝,向外分泌一系列化學(xué)物質(zhì)包被在邊緣細(xì)胞的外側(cè)構(gòu)成黏膠層,對根邊緣細(xì)胞具有保護作用[23]。當(dāng)根邊緣細(xì)胞受到生物或非生物脅迫時迅速向胞外釋放多種化學(xué)物質(zhì),使黏膠層進(jìn)一步增厚,以吸附或排斥病原體[24],螯合有毒物質(zhì)[25],緩解脅迫帶來的傷害。喬永旭等[21]研究發(fā)現(xiàn),化感物質(zhì)肉桂酸作用下,黃瓜(CucumissativusL.)根邊緣細(xì)胞黏膠層增厚,在一定程度上抵御了化感脅迫對根尖的傷害。李安奇等[25]報道,當(dāng)大豆根邊緣細(xì)胞受到土荊芥化感物質(zhì)脅迫時,根邊緣細(xì)胞周圍形成了一些顆粒狀物質(zhì),可能與螯合化感物質(zhì)有關(guān)。本研究結(jié)果表明,紫莖澤蘭提取物作用下,3種雜草根邊緣細(xì)胞黏膠層厚度隨提取物濃度的升高而顯著增厚。說明,根邊緣細(xì)胞受到提取物化感脅迫,向外釋放了大量的化學(xué)物質(zhì),以吸附或螯合提取物,阻滯提取物進(jìn)一步向細(xì)胞內(nèi)滲透。這一現(xiàn)象與豌豆(PisumsativumL.)根邊緣細(xì)胞受到鋁脅迫[26]、玉米根邊緣細(xì)胞受到銅和土荊芥化感物質(zhì)脅迫[11,27],出現(xiàn)根邊緣細(xì)胞黏膠層厚度增厚的現(xiàn)象相類似。由此可見,根邊緣細(xì)胞黏膠層厚度增加是其應(yīng)對化感脅迫的一種保護性生理反應(yīng)。

植物受到外界脅迫時會產(chǎn)生一些應(yīng)急機制來避免自身受到嚴(yán)重的傷害,例如產(chǎn)生更多的根邊緣細(xì)胞來抵御脅迫[28]。根邊緣細(xì)胞的產(chǎn)生速率與果膠甲基酯酶(PME)密切相關(guān),PME通過果膠去甲基化,果膠酸分解,誘導(dǎo)其它果膠酶基因的表達(dá),最終促進(jìn)根邊緣細(xì)胞從根冠釋放[29]。本研究結(jié)果顯示,稗草PME活性隨提取物濃度的升高無明顯的變化,而灰綠藜和反枝莧PME活性呈現(xiàn)隨提取物濃度的升高而上升的變化趨勢。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是提取物脅迫誘導(dǎo)雜草通過上調(diào)根冠細(xì)胞中PME基因的表達(dá),使PME活性升高以促進(jìn)根邊緣細(xì)胞的產(chǎn)生。然而,試驗中3種雜草PME活性與RBCs數(shù)量變化趨勢相反,這可能是隨提取物濃度的升高,根尖組織受損加劇,產(chǎn)生根邊緣細(xì)胞的能力不斷下降所致。

化感脅迫作用下,PME活性變化還與受體植物對化感脅迫的耐性有密切關(guān)系,對化感脅迫敏感的受體植物PME活性變化較強烈[30]。本研究結(jié)果顯示,隨提取物濃度的升高,稗草的PME活性變化不明顯,而灰綠藜、反枝莧PME活性較明顯,1000 mg/L提取物脅迫時,PME活性與其對照比均達(dá)到顯著差異。說明,灰綠藜、反枝莧對提取物脅迫比較敏感,而稗草不敏感。這也可從提取物脅迫下3種雜草種子萌發(fā)生長指標(biāo)、提取物對根尖的損傷觀察結(jié)果中得到印證。

4 結(jié)論

紫莖澤蘭提取物對稗草、灰綠藜、反枝莧種子萌發(fā)生長有較強烈的化感脅迫作用,抑制種子的萌發(fā)和幼苗生長。紫莖澤蘭化感物質(zhì)抑制雜草根邊緣細(xì)胞的產(chǎn)生,誘導(dǎo)邊緣細(xì)胞發(fā)生凋亡,破壞根邊緣細(xì)胞對根尖的保護系統(tǒng),化感物質(zhì)進(jìn)一步對根尖產(chǎn)生脅迫傷害,破壞根尖的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu),使根尖不能發(fā)揮正常的運輸水分和營養(yǎng)代謝的功能,從而抑制種子的萌發(fā)和早期幼苗的生長。紫莖澤蘭提取物可開發(fā)成植物源除草劑,用于3種雜草的綠色防控。

參考文獻(xiàn)(References):

[1] Zhu L, Sun O J, Sang W G, Li Z Y, Ma K P. Predicting the spatial distribution of an invasive plant species(Eupatoriumadenophorum) in China. Landscape Ecology, 2007, 22(8): 1143- 1154.

[2] Zhao X, Zheng G W, Niu X M, Li W Q, Wang F S, Li S H. Terpenes fromEupatoriumadenophorumand their allelopathic effects onArabidopsisseeds germination. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(2): 478- 482.

[3] 莊啟明, 侯婧, 周東新, 王玉英, 李華民, 曹坳程. 紫莖澤蘭化學(xué)成分化感作用及生物活性. 北京師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2008, 44(6): 610- 613.

[4] 鄭麗, 馮玉龍. 紫莖澤蘭葉片化感作用對10種草本植物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響. 生態(tài)學(xué)報, 2005, 25(10): 2782- 2787.

[5] 王亞麒, 焦玉潔, 陳丹梅, 袁玲, 黃玥, 吳葉寬, 杜如萬. 紫莖澤蘭浸提液對牧草種子發(fā)芽和幼苗生長的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(2): 150- 159.

[6] 林玉鎖, 龔瑞忠. 農(nóng)藥環(huán)境管理與污染控制. 環(huán)境導(dǎo)報, 2000,(3): 4- 6.

[7] 卜元卿, 孔源, 智勇, 王金燕, 單正軍. 化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染及其防控對策建議. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2014, 16(2): 19- 25.

[8] Ma J H, Xing G F, Yang W X, Ma L L, Gao M, Wang Y G, Han Y H. Inhibitory effects of leachate fromEupatoriumadenophorumon germination and growth ofAmaranthusretroflexusandChenopodiumglaucum. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(1): 50- 56.

[9] 國家技術(shù)監(jiān)督局. GB/T 3543—1995 農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1995.

[10] 范華, 董寬虎, 方志紅, 趙祥. 堿蒿營養(yǎng)器官的掃描電鏡觀察研究. 激光生物學(xué)報, 2010, 19(3): 314- 320.

[11] 胡忠良, 王亞男, 馬丹煒, 陳斌, 何亞強, 周健. 玉米根邊緣細(xì)胞exDNA和胞外蛋白對土荊芥化感脅迫的緩解效應(yīng). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(10): 1962- 1970.

[12] 馬春紅, 李秀麗, 董文琦, 張紅心, 李運朝, 崔四平, 王立安, 賈銀鎖, 戴志剛. HMC毒素誘導(dǎo)玉米同核C、N細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞凋亡的熒光顯微觀察. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(9): 1823- 1829.

[13] Cai M Z, Zhang S N, Xing C H, Wang F M, Wang N, Zhu L. Developmental characteristics and aluminum resistance of root border cells in rice seedlings. Plant Science, 2011, 180(5): 702- 708.

[14] Qiao Y X, Zhang Y P, Zhang H X, Tian Y Q, Gao L H. Developmental characteristics and cinnamic acid resistance of root border cells in cucumber and figleaf gourd seedlings. Journal of Integrative Agriculture, 2013, 12(11): 2065- 2073.

[15] Babula P, Vanco J, Kohoutkova V, Dankova I, Havel L, Kizek R. Cell signals as markers of cytotoxicity of new complexes of naphthoquinones. Analysis of Biomedical Signals and Images, 2010, 20: 259- 263.

[16] Li Z H, Wang Q, Ruan X, Pan C D, Jiang D A. Phenolics and plant allelopathy. Molecules, 2010, 15(12): 8933- 8952.

[17] 胡琬君, 馬丹煒, 王亞男, 張紅, 李群. 土荊芥揮發(fā)油對蠶豆根尖細(xì)胞的化感潛力. 生態(tài)學(xué)報, 2011, 31(13): 3684- 3690.

[18] Yang G Q, Wan F H, Guo J Y, Liu W X. Cellular and ultrastructural changes in the seedling roots of upland rice(Oryzasativa) under the stress of two allelochemicals fromAgeratinaadenophora. Weed Biology and Management, 2011, 11(3): 152- 159.

[19] Hamamoto L, Hawes M C, Rost T L. The production and release of living root cap border cells is a function of root apical meristem type in dicotyledonous angiosperm plants. Annals of Botany, 2006, 97(5): 917- 923.

[20] 李榮峰, 蔡妙珍, 劉鵬, 梁和, 徐根娣. 植物根邊緣細(xì)胞的抗逆性研究進(jìn)展. 廣西植物, 2007, 27(3): 497- 502.

[21] 喬永旭. 黃瓜和黑籽南瓜幼苗根系邊緣細(xì)胞對肉桂酸脅迫的應(yīng)答差異. 園藝學(xué)報, 2015, 42(5): 890- 896.

[22] Iijima M, Barlow P W, Bengough A G. Root cap structure and cell production rates of maize(Zeamays) roots in compacted sand. New Phytologist, 2003, 160(1): 127- 134.

[23] Hawes M C, Gunawardena U, Miyasaka S, Zhao X W. The role of root border cells in plant defense. Trends in Plant Science, 2000, 5(3): 128- 133.

[24] Wen F S, White G J, VanEtten H D, Xiong Z G, Hawes M C. Extracellular DNA is required for root tip resistance to fungal infection. Plant Physiology, 2009, 151(2): 820- 829.

[25] 李安奇, 王亞男, 張紅, 汪利沙, 馬丹煒. 大豆根邊緣細(xì)胞對土荊芥組培根分泌物的響應(yīng). 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2012, 21(1): 84- 87.

[26] 馮英明, 喻敏, 溫海祥, 張英慧, 蕭洪東, 王惠珍, 何麗爛, 梁火娣. 鋁對豌豆根邊緣細(xì)胞存活率和粘膠層厚度的影響. 生態(tài)環(huán)境, 2005, 14(5): 695- 699.

[27] 劉婷婷, 李鋒, 張曦, 施積炎, 陳英旭. 銅離子脅迫下玉米根邊緣細(xì)胞數(shù)量及存活率. 植物生理學(xué)報, 2012, 48(7): 669- 675.

[28] 李榮峰, 蔡妙珍, 劉鵬, 徐根娣, 梁和, 周主貴. 邊緣細(xì)胞對大豆根尖鋁毒害的緩解效應(yīng). 作物學(xué)報, 2008, 34(1): 318- 325.

[29] 何兵, 汪利沙, 王亞男, 張紅, 李群, 馬丹煒. 土荊芥揮發(fā)油對豌豆根邊緣細(xì)胞的誘導(dǎo)和脅迫作用. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2013, 22(6): 991- 995.

[30] 李學(xué)文, 李亞林, 楊錦, 吳禮樹, 蕭洪東, 馮英明, 劉家友, 喻敏. 豌豆不同耐鋁品種根尖細(xì)胞壁果膠及其甲基酯化度的差異. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2016, 22(3): 729- 735.