超聲輔助提取尾葉香茶菜總二萜工藝研究

周天嬌，李春燕,2，韓莉萍，李亞娟，吳艷芳*(．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453002；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 藥學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

尾葉香茶菜Rabdosiaexcise(Maxim.)Hara屬于唇形科香茶菜屬的植物，全草入藥，性涼、味甘，具有清熱解毒、抗菌消炎、活血化瘀的功效。尾葉香茶菜主要含有萜類、黃酮類和揮發(fā)油等成分，其中萜類主要是對(duì)映-貝殼杉烷型二萜化合物，具有良好的抗腫瘤作用[1-4]。超聲輔助提取可提高有效成分的提取速度和提取效率[5-6]，目前,此方法對(duì)二萜類化合物的提取有先例，但其影響因素并不齊全，本研究通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)多方面考察超聲輔助提取尾葉香茶菜中二萜成分的提取工藝[7-13]，研究最佳的提取工藝條件，探索一種簡便、快速、效率高的提取方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

尾葉香茶菜(2012年8月采集于吉林省磐石市，植物標(biāo)本存在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)標(biāo)本館)，對(duì)照化合物Kamebakaurin(從尾葉香茶菜中提取分離所得，純度98%以上)，無水乙醇(分析純)，蒸餾水(自制)。

KQ-600KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，L400)，電子天平(十萬分之一，萬分之一，XS205型，瑞士Mettler Toledo公司)，TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取尾葉香茶菜二萜類化合物Kamebakaurin對(duì)照品適量， 精密稱定，加70%乙醇溶解并制成每1 mL中含Kamebakaurin約0.2 mg的溶液，作對(duì)照品儲(chǔ)備液，在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品溶液的制備

取樣品提取液0.1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，以同樣的方法在235 nm處測定其吸光度A，按回歸方程計(jì)算總二萜含量。

2 結(jié)果和討論

2.1 方法學(xué)研究

2.1.1 測定波長的選擇

取對(duì)照品溶液，以70%乙醇為空白對(duì)照，在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在235 nm處有最大吸收，故選取235 nm為檢測波長。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，分別精密量取0.50，0.60，0.80，1.00，1.50 mL置于10 mL容量瓶中，并用70%乙醇定容至刻度，搖勻，分別依法進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程為Y=22.446×-0.0088,r2=0.999 7，結(jié)果表明， Kamebakaurin在0.010～0.030 mg·mL-1范圍內(nèi)呈很好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗(yàn)考察

取樣品A3連續(xù)測定5次，記錄吸光度值，RSD為0.77%，表明本方法精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察

將樣品A3每隔10 min測定一次吸光度，連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，RSD為2.46%，表明樣品溶液在1 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率

精密稱取已知總二萜含量的尾葉香茶菜0.5 g，共6份，分別加入約0.05 g對(duì)照品，測定吸光度計(jì)算加樣回收率，平均回收率為100.40%，RSD為2.13%。

方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，采用紫外分光光度法測定尾葉香茶菜總二萜含量，重現(xiàn)性好，簡單方便，穩(wěn)定可靠。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 單因素試驗(yàn)

分別以乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、溫度和功率為主要因素來進(jìn)行單因素試驗(yàn)，乙醇濃度分別考察了50%，60%，70%，80%，90%，95%的乙醇、提取時(shí)間分別考察了10，20，30，40，50，60 min的超聲提取時(shí)間、提取溫度分別考察了30，40，50，60，70℃的超聲提取溫度、功率分別考察了300，360，420，480，540 W的超聲提取功率，以上樣品的提取液以3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液按“1.2.2樣品溶液的制備”測定吸光度，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，在乙醇濃度為60%時(shí)二萜類化合物的提取效率最高，故乙醇濃度控制在50%～70%為佳；二萜含量隨著提取時(shí)間的增加而增加，考慮到試驗(yàn)效率，提取時(shí)間在20 min后，總二萜的含量相差不大，故提取時(shí)間選取20 min；提取溫度在50℃時(shí)總二萜的提取效率最高，故溫度條件控制在30～60℃為佳；隨著提取功率的增加，提取效率不斷地上升，其中在300～420 W之間提取效率增加幅度最大，考慮經(jīng)濟(jì)因素和成本因素，超聲功率選擇300～420 W為佳，研究結(jié)果表明最佳提取工藝為60%乙醇濃度、使用300～420 W的超聲功率在50℃提取20 min。

圖1 尾葉香茶菜總二萜提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理[14]，再根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定提取時(shí)間設(shè)定為20 min，如表1以乙醇濃度、提取溫度、超聲功率三因素作為自變量，總二萜提取含量比率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平一共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)。采用Design-Exipert軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2，使用二次多項(xiàng)式回歸，擬合得到總二萜含量對(duì)3個(gè)因素功率(A)、溫度(B)、乙醇濃度(C)的二次多項(xiàng)式方程為：

Y=-36.58+0.03A+0.27B+0.83C-1.52×10-4AB+6.20×10-4AC-3.94×10-4BC-8.05×10-5A2-1.33×10-3B2-8.24×10-3C2

表1 尾葉香茶菜總二萜提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，P=0.011 8，說明該模型方程顯著，失擬項(xiàng)的P=0.8927，意味著失擬項(xiàng)不顯著；由表2可知，B(溫度)是極顯著性因素(P=0.0008)，C和C2是顯著因素(P<0.05)，表明C(乙醇濃度)對(duì)提取二萜類化合物的影響不是簡單的線性關(guān)系。超聲功率對(duì)二萜類成分提取影響不顯著(P>0.05)。由圖2可知，二萜類化合物含量隨溫度的升高而增加，隨著乙醇濃度的增加而增加，當(dāng)溫度為60℃和乙醇濃度為64.13%時(shí)，到達(dá)最大值。R2=0.890 5，說明了該模型能夠解釋89.05%響應(yīng)值的變化。adjR2與 Pred R2值相差不大，表明該響應(yīng)面方程不需要再做進(jìn)一步的優(yōu)化。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)提取總二萜的含量方差分析結(jié)果

注：R2=0.890 8；adj R2=0.750 3；Pred R2=0.625 3；*P<0.05，**P<0.01

圖2 提取溫度和乙醇濃度對(duì)二萜類類物質(zhì)提取率的響應(yīng)面和等高線圖

通過軟件分析Y最大時(shí)，A=397.75，B=60.00，C=64.13，考慮可行性，結(jié)果修正為功率400 W，溫度60℃，乙醇濃度64%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，以最優(yōu)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算尾葉香茶菜總二萜含量，求得平均值為5.48%，而預(yù)測總二萜的含量為5.54%，實(shí)際值與預(yù)測值較為接近，驗(yàn)證了所建立的模型的正確性，也說明了響應(yīng)面的分析方法適合于尾葉香茶菜中總二萜的超聲輔助提取工藝的優(yōu)化。

3 結(jié)論

本文研究了超聲輔助提取尾葉香茶菜總二萜工藝的優(yōu)化。含量測定中以Kamebakaurin作為對(duì)照品，采用紫外分光光度法來測定尾葉香茶菜中總二萜的含量，方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，采用紫外分光光度法測定尾葉香茶菜總二萜含量，重現(xiàn)性好，簡單方便，穩(wěn)定可靠。

單因素試驗(yàn)分別以乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、溫度和功率為主要因素來進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過比較總二萜的提取率確定了最佳提取工藝的乙醇濃度、超聲功率、提取溫度和時(shí)間。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理，使用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，以乙醇濃度、提取溫度、超聲功率三因素作為自變量，總二萜提取含量比率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平一共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并使用二次多項(xiàng)式回歸建立響應(yīng)面方程對(duì)提取工藝進(jìn)行篩選和優(yōu)化，最終確立其最佳的提取條件為：功率400 W，溫度60℃，乙醇濃度64%。本法可節(jié)省時(shí)間和溶劑，生產(chǎn)成本也較低，建立一個(gè)提取二萜化合物的工藝流程，為開發(fā)利用此資源提供了另一條途徑。

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