東北油豆角枯萎病病原菌的分離、純化與鑒定

王 杰，周 萌，杜偉玲

（哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心，黑龍江 哈爾濱 150029）

油豆角是我國東北地區(qū)（黑龍江、吉林為主）特有的一種優(yōu)質(zhì)食莢菜豆品種，含有較高的蛋白質(zhì)（干質(zhì)量的20%以上），含有人體必須的18種氨基酸、豐富的膳食纖維、多種維生素和礦物質(zhì)。

油豆角枯萎病俗稱萎蔫病、死秧。一般發(fā)病率在30%～50%，個別重病田病株率高達(dá)90%以上。病原菌通過根部傷口或根毛頂端細(xì)胞侵入，進(jìn)入寄主導(dǎo)管內(nèi)發(fā)育，隨水分的運(yùn)輸迅速擴(kuò)展到植株頂端，堵塞導(dǎo)管，而使病株萎蔫。初花期開始發(fā)病，結(jié)莢盛期植株大量枯死，嚴(yán)重阻礙油豆角生產(chǎn)。

為了控制枯萎病的危害，首先要研究其發(fā)病的原因。試驗對引起發(fā)病的病原菌進(jìn)行分離和鑒定，以期為有針對性地防治該病害奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

PSA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉15 g，加水至1 000 mL，pH值5.0～6.0；致病性鑒定所使用的油豆角品種：將軍一點紅（當(dāng)?shù)刂髟云贩N）。試劑盒：Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離

采用組織分離法：將剪取的油豆角莖基部病組織樣品經(jīng)2.0%（V/V）NaClO表面滅菌0.5～1.0 min，再用滅菌蒸餾水沖洗。用滅菌濾紙將樣品擦干，后用解剖刀將其切成小薄片，置于含有PSA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，28±2 ℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)5～7 d，將從樣本中得到的分離物進(jìn)行單孢分離（稀釋分離法），將單孢分離物轉(zhuǎn)接于新的含有PSA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，28±2 ℃條件下培養(yǎng)7 d備用。

1.2.2 病原菌的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)7～10 d后觀察菌絲體形態(tài)，采用數(shù)碼倒置顯微鏡EVOS觀察其分生孢子的形態(tài)。

致病性測定：病原菌的接種方法參考Haware和Nene[1]的方法。將玉米粉與蛭石按1∶2（V/V）的比例制成混合物，在1 000 mL規(guī)格的三角瓶中裝入400 mL混合物，121 ℃、0.2 MPa條件下滅菌30 min，滅菌2次。向玉米粉混合物中加入50 mL滅菌蒸餾水，混合均勻后接入病原菌（培養(yǎng)皿直徑為90 mm，且長滿病原菌菌絲），25～28 ℃條件下培養(yǎng)7～10 d，每天搖晃三角瓶使病原菌均勻生長。將接種體與滅菌的營養(yǎng)土按照1∶10（V/V）的比例混合，取0.01 g接種混合土懸浮于1 mL滅菌水中，用血球計數(shù)板計算接種混合土中病原菌的含量，使接種終濃度達(dá)到5.0×106cfu/g。將用0.5%NaClO溶液表面滅菌的油豆角種子播種于裝有上述接種混合土的營養(yǎng)缽中，致病性測定在人工氣候箱中進(jìn)行，30±2 ℃條件下，每日光照12 h，適時澆水。以未接種病菌的滅菌營養(yǎng)土作為對照，定期觀察植株生長情況。根據(jù)柯赫氏法則，從發(fā)病的植株上再次分離病原菌進(jìn)行純培養(yǎng)，并觀察其特征。

分子生物學(xué)鑒定：應(yīng)用Ezup柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒進(jìn)行病原菌基因組DNA提取。PCR擴(kuò)增采用真菌鑒定通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；PCR 反應(yīng)體系：Template（基因組 DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL、10×Buffer（加Mg2+）2.5 μL、dNTP（各2.5 mM）1 μL、Taq酶0.2 μL、ITS1（10 μM）0.5 μL、ITS4（10 μM）0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR循環(huán)條件：預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共計30個循環(huán)，然后72 ℃延伸修復(fù)10 min，4 ℃終止反應(yīng)；用1%瓊脂糖凝膠電泳，150 V、100 mA電泳20 min；用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收目標(biāo)條帶，PCR產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司直接測序。將測得的rDNA-ITS序列放到NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫中，并利用BLAST技術(shù)進(jìn)行分析。

專化型鑒定：方法同上述致病性鑒定方法，只是把接種對象擴(kuò)大到豇豆、扁豆、豌豆、菜用大豆和蠶豆，其中包括油豆角，每處理接30株苗，以清水處理作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)

在固體馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養(yǎng)基上，菌落呈淡紫色；大型分生孢子鐮刀形，有3～5個隔；小型分生孢子橢圓形，有0～1個隔（圖1）。

2.2 病原菌的致病性鑒定

未接種病原菌的植株正常生長（圖2-A左）；接種病原菌的植株出現(xiàn)的白化現(xiàn)象后萎蔫（圖2-A右），其莖的維管束變褐色（圖2-B）。試驗共分離到鐮刀菌菌株6株，其中對油豆角（將軍一點紅）有致病性的1株。

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

病原菌的rDNA-ITS序列測定結(jié)果如下：

將DNA序列放到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中通過BLAST比對，結(jié)果顯示此序列與近100個尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）分離物或?qū)；屯葱赃_(dá)100%，由此可以推斷，病原菌應(yīng)該屬于尖孢鐮刀菌種。

2.4 ?；丸b定

以清水為對照，寄主為油豆角，其發(fā)病率為0.00%。另外，從表1可以看出：病原菌強(qiáng)侵染油豆角，弱侵染豇豆，不侵染扁豆、豌豆、菜用大豆和蠶豆。

3 結(jié)論與討論

鐮刀菌的鑒定是一項非常復(fù)雜的工作，傳統(tǒng)方法主要采用形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)作為判斷依據(jù)，方法容易受多種外界因素的影響而產(chǎn)生很大的不確定性。自從發(fā)現(xiàn)真菌rDNA-ITS區(qū)具有豐富變異的特點，常常將這一可變區(qū)作為真菌菌種和分離物鑒定的可靠依據(jù)之一[2]。劉波等[3]對引起瓜類枯萎病的尖孢鐮刀菌多個菌株的rDNA-ITS區(qū)序列及串珠鐮孢菌多個菌株的rDNA-ITS區(qū)序列進(jìn)行多重比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：來自不同?；偷木阹DNA-ITS區(qū)序列可能完全相同，而同一?；偷木阹DNA-ITS區(qū)序列也有可能存在一定的差異，說明ITS區(qū)序列無法用于區(qū)分菌株的專化型。另外，余仲東等[4]也認(rèn)為ITS區(qū)序列不適于種下階元劃分。研究中，2株病原菌rDNA-ITS區(qū)序列與近100個尖孢鐮刀菌分離物或?qū)；偷耐葱赃_(dá)100%，再次驗證了通過rDNA-ITS區(qū)序列只能鑒定到種而無法鑒定到種以下分類單元（比如?；停┻@一事實。

表1 尖孢鐮刀菌?；丸b定結(jié)果

圖1 病原菌形態(tài)及分生孢子

圖2 油豆角病原菌的致病性鑒定情況

張吉祥等[5]歸納總結(jié)了DNA分子標(biāo)記（包括RFLP、RAPD、AFLP、ISSR和SCAR等）、毒性基因和轉(zhuǎn)座子等技術(shù)在尖孢鐮刀菌?；图捌渖硇》N鑒別方面的應(yīng)用，指出分子方法盡管具有快速、靈敏、特異性高等諸多優(yōu)點，但也都有各自的局限性，限制了其廣泛應(yīng)用。在生產(chǎn)上，尖孢鐮刀菌?；丸b定大部分還是利用傳統(tǒng)的鑒定方法，主要通過菌株在不同作物上的致病性測定。

結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和?；偷蔫b定結(jié)果，可初步把病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌菜豆?；?。

[1]HAWARE M P, NENE Y L. Races ofFusarium oxysporum[J]. Plant Disease,1982,66(9):809-810.

[2]SCHMIDT O, MORETH U. Data band of rDNA-ITS sequences from building-rot fungi for their identification[J]. Wood Science and Technology,2002,36(5):429-433.

[3]劉波,黃俊生,肖榮鳳.尖孢鐮刀菌生物學(xué)及其生物防治[M].北京:科學(xué)出版社,2013.

[4]余仲東,劉小勇,曹支敏.松楊柵銹菌的ITS序列和微衛(wèi)星分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(6):31-34.

[5]張吉祥,凌鍵,謝丙炎.尖孢鐮刀菌專化型及生理小種分子檢測研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2013,29(36):338-342.蔬