消渴蛋白Ⅰ號顆粒制備工藝優(yōu)化及質(zhì)量標準的建立

初洪波，成光宇，于秀華

（長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021）

消渴蛋白 Ⅰ 號為國家級名中醫(yī)南征教授應用解毒通絡保腎法治療消渴腎?。ㄌ悄虿∧I?。┑慕?jīng)驗方[1-13]。糖尿病腎病是一種嚴重的糖尿病并發(fā)癥，是以腎小球硬化為特征的繼發(fā)性腎臟疾病，其臨床表現(xiàn)為腎功能進行性損害、高血壓、水腫、蛋白尿，是終末期腎衰的主要原因，糖尿病腎病的中醫(yī)辨證的病機關(guān)鍵是毒損腎絡。消渴蛋白Ⅰ 號臨床應用20余年，臨床病例達到三千多例，經(jīng)臨床研究證實其可消除蛋白尿癥狀，在良好的臨床療效基礎上，擬進行院內(nèi)制劑開發(fā)。

1 材料與儀器

JH2102電子天平（上海精密科學儀器有限公司），ZY-TS-NS-100多功能提取濃縮裝置（上海紫裕生物科技有限公司），DZF型真空干燥箱（上海博迅），WCH-10小型混合槽（濰坊市北方制藥設備有限公司），小型搖擺式顆粒機（上海天和制藥機械廠），CAMAG型薄層色譜成像儀（瑞士CAMAG公司）。試劑均為分析純； 五倍子對照藥材（批號121078-201312），丹酚酸B對照品（批號111562-201110），丹參對照藥材（批號120923-201113），陳皮對照藥材（批號120969-201211）以上對照藥材及對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G、硅膠GF254薄層板為青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)；消渴蛋白Ⅰ號顆粒小試樣品1、樣品2、樣品3，批號分別為： 20160801、20160802、20160803，均由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗中心提供。

2 處方及制備工藝［14-24］

2.1 處方 白蔻仁、覆盆子、絡石藤、五倍子、蟬蛻、白僵蠶、陳皮、丹參、黨參、黃芪、黃精、土茯苓、白茅根。

2.2 制備工藝 以上14味，煎煮3次，每次2 h，加水量為8倍。煎煮液濾過，合并濾液，濾液濃縮稠膏（80 ℃時測定相對密度為1.20～1.25），按乳糖-稠膏2:1加入輔料，小型混合槽混勻，小型搖擺式顆粒機制成顆粒，80 ℃干燥，整粒，制成1 000 g，分裝，即得。

2.3 水提最佳工藝的建立 據(jù)文獻報道，藥材主要活性成分為水溶性，結(jié)合本處方作為湯劑在臨床應用多年，療效確切的實際情況，采用水煎煮法對其進行提取。根據(jù)經(jīng)驗，確定影響提取效果的有3個主要因素，即A：煎煮時每次加水量；B：煎煮時間；C：煎煮次數(shù)。結(jié)合實際情況，為每個因素確定了3個水平，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝條件。以出膏率作為正交試驗的考察指標，對主要影響因素（加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)），進行三因素三水平L9（34）正交試驗設計（見表1），以篩選最佳工藝。

表1 L9（34）正交試驗因素及水平

試驗方法：按處方比例稱取白蔻仁等14味藥材（總質(zhì)量62 g），按表2方案進行試驗，以出膏率為指標進行分析，結(jié)果見表2、表3。出膏率（%）=提取物質(zhì)量（g）/62×100%

表2 L9（34）正交試驗安排及結(jié)果分析

表3 方差分析表

通過方差分析（見表3）和直觀分析（見表2）可知，A因素（加水量）、B因素（提取時間）無顯著性，C因素（提取次數(shù)）有顯著性（＜0.05）。各因素與水平的組合應為A2B3C3。確定最佳提取工藝為：煎煮3次，時間為每次2 h，加水量為藥材量的8倍。

表4 水提取工藝的驗證試驗

結(jié)果可見，按此工藝，出膏率穩(wěn)定，確定最佳工藝為A2B3C3，即加水煎煮3次，每次2 h，加水量為8倍。2.4 消渴蛋白Ⅰ號顆粒的成型工藝研究

2.4.1 稠膏的制備 處方藥材按優(yōu)化的最佳提取條件提取后，濾過，合并濾液，濃縮至稠膏（80 ℃時測定相對密度為1.20～1.25）。

2.4.2 輔料的選擇 加入麥芽糊精、糊精、可溶性淀粉做為制粒輔料，輔料與稠膏的比例為2:1，制粒時軟材情況與輔料種類的關(guān)系，見表5。

表5 制粒輔料選擇的考察

通過以上研究，確定本制劑采用乳糖做為輔料。2.4.3 顆粒干燥溫度的選擇 選用不同溫度，干燥時間為6 h，對顆粒的干燥條件進行了考察，觀察顆粒的干燥情況，并測定水分，結(jié)果見表6。

表6 濕顆粒干燥溫度試驗

結(jié)果可見，60 ℃條件下干燥6 h，其水分含量超出藥典要求；而70 ℃干燥，水分稍高，接近限度值，故選擇80 ℃為顆粒干燥溫度。

2.5 顆粒的流動性考察 取制粒后的顆粒，以休止角作為流動性評價指標，考察顆粒的流動性。物料休止角平均為34.4°，表明物料流動性較好。

2.6 顆粒吸濕性的考察 一般條件下，藥品生產(chǎn)車間GMP要求的相對濕度為45%～65%，為了考察生產(chǎn)條件下顆粒的吸濕性，并計算吸濕率。

經(jīng)測定，20 ℃恒溫放置48 h，顆粒的吸濕率為4.6%，表明本品吸濕不是很強。因此，顆粒在干燥后，應控制相對濕度小于65.0%的條件下進行包裝，并采取防潮效果好的鋁塑復合膜包裝，可以控制產(chǎn)品含水量。2.7 包裝材料 為保證藥物的穩(wěn)定性，制劑的內(nèi)包材選擇鋁塑復合膜。

經(jīng)過3批樣品加速條件下6個月的穩(wěn)定性考察及正常條件下24個月的穩(wěn)定性考察，產(chǎn)品穩(wěn)定性良好，說明制劑與內(nèi)包材兼容性較好。

3 消渴蛋白Ⅰ號顆粒質(zhì)量標準研究[25-38]

3.1 性狀 對多批樣品的顏色，氣、味綜合觀察，最后確定本品的性狀為：本品為黃色至棕黃色的顆粒；味苦，微甜。

3.2 鑒別

3.2.1 處方中五倍子的薄層鑒別 五倍子主要有效成分為五倍子鞣質(zhì)，含量約為60%～70%，甚至高達80%；沒食子酸2%～4%，樹脂、蠟質(zhì)等。供試品溶液的制備方法：取渴蛋白Ⅰ號顆粒20 g，研成細粉，加20 mL甲醇，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解；對照藥材溶液的制備方法：按供試品溶液的制備方法將五倍子對照藥材0.5 g，加甲醇10 mL制成對照藥材溶液；對照品溶液制備方法：取沒食子酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。陰性對照液制備方法：按處方和制法制備不含五倍子的陰性樣品、按供試品溶液制備方法制成陰性對照液。分別吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上。展開劑：環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（10:10:1）。顯色劑和顯色方法：置于紫外光燈（254 nm）下檢視。層析結(jié)果見圖1。

圖1 五倍子薄層鑒別

3.2.2 處方中丹參的薄層鑒別 供試品溶液的制備方法：取渴蛋白Ⅰ號顆粒20 g，研成細粉，加25 mL 75%甲醇超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水100 mL使溶解，濾過，通過內(nèi)徑為2 cm，柱高為15 cm 的D101型大孔吸附樹脂柱，棄去200 mL水洗脫液，收集200 mL70%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解。陰性對照液制備方法：按處方和制法制備不含丹參陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成不含丹參的陰性對照溶液。對照藥材溶液的制備方法：按供試品溶液的制備方法將丹參對照藥材1 g制成對照藥材溶液。對照品溶液制備方法：取丹酚酸B對照品，加75%甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上。展開劑：甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2:3:4:0.5:2）。顯色劑和顯色方法：置紫外光燈（254 nm）下檢視。層析結(jié)果見圖2。

圖2 丹參薄層鑒別

3.2.3 處方中陳皮的薄層鑒別 供試品溶液的制備方法：渴蛋白Ⅰ號顆粒20 g，研成細粉，加50 mL乙酸乙酯超聲處理30 min，濾過，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解。陰性對照液制備方法：按處方和制法制備不含陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成不含陳皮的陰性對照溶液。對照藥材溶液的制備方法：按供試品溶液的制備方法將陳皮對照藥材1 g制成對照藥材溶液。對照品溶液制備方法：取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上。展開劑和展開方式：乙酸乙酯-甲醇-水（100:17:13）為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20:10:1:1）的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干。顯色劑和顯色方法：噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。層析結(jié)果見圖3。

圖3 陳皮薄層鑒別

3.3 檢查 按顆粒劑項下的要求（收載于中國藥典2015年版四部通則0104），檢查渴蛋白Ⅰ號顆粒3批樣品（批號20160801、20160802、20160803）的裝量差異、溶化性、粒度、水分、微生物限度、重金屬及砷鹽。

4 小結(jié)

消渴蛋白Ⅰ號顆粒選擇了可溶性淀粉作為輔料，顆粒呈黃褐色、微甜、顆粒成型、溶化性好，方便了患者的服用。本文確定了最佳工藝條件和質(zhì)量控制標準。

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