葡萄糖-6-磷酸脫氫基因檢測(cè)技術(shù)在蠶豆病診斷中的應(yīng)用

羅家宏

（廣東省江門市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心 江門 529000）

蠶豆病是一種X連鎖不完全顯性遺傳性溶血性疾病，其實(shí)質(zhì)是G6PD基因發(fā)生突變，故又被稱之為G6PD缺乏癥。該病男性發(fā)病率高于女性，致病機(jī)制是G6PD基因發(fā)生突變，編碼蛋白結(jié)構(gòu)受到影響進(jìn)而引起G6PD酶的活性降低[1]。該病在世界范圍內(nèi)約4億人受累，以地中海周圍、印度、東南亞等地區(qū)高發(fā)。我國(guó)分布于海南、廣東、廣西、云南等地，發(fā)病率在11%左右，極個(gè)別地區(qū)可達(dá)30%以上[2]。為進(jìn)一步探究診斷效果，本研究將我院收治的128例蠶豆病患者作為研究對(duì)象，探討不同檢測(cè)技術(shù)在蠶豆病診斷中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 對(duì)我院2016年12月～2017年12月收治確診為蠶豆病的128例患者進(jìn)行分析，男78例，女50例，年齡 21～62歲，平均（39.44±3.51）。均進(jìn)行熒光定量PCR法檢測(cè)及高鐵血紅蛋白還原法檢測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑 BeckmanCoulter DXC800全自動(dòng)生化分析儀、ABI 7500熒光PCR儀。高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)MHBR試劑（2.5%的NaNO2和0.000 4 M美蘭等量混合），引物（美國(guó)Invitrogen公司），Hot Star Taq酶（德國(guó)Qiagen公司）。

1.2.2 檢測(cè)方法 熒光定量PCR法：對(duì)128例患者EDTA抗凝靜脈血用QIAamp DNA Blood Mini Kit按照說明書提取DNA，－20℃保存，以熒光PCR方法為技術(shù)原理，通過設(shè)計(jì)特異的Taqman探針對(duì)6 個(gè) 常 見 突 變 位 點(diǎn)（G1376T、G1388A、A95G、A871G、G392T、C1024T）進(jìn)行合管檢測(cè)，以有無擴(kuò)增曲線做定性突變檢測(cè)，同時(shí)以人類基因組的β-actin基因?yàn)槟０嬖O(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行內(nèi)控監(jiān)測(cè)。模板制備和引物、探針設(shè)計(jì)合成按QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書操作提取外周血DNA，－20℃保存。多重PCR引物和特異識(shí)別突變位點(diǎn)的Taqman MGB探針設(shè)計(jì)用Primer Express 3.0軟件完成，由上海英濰捷基公司合成。PCR體系及程序PCR體系：G6PD基因A、B兩管三重PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積均為25 μl，包括DNA模板2 μl（總量 20～100 ng），10×Hot Star Taq PCR 緩沖液2.5 μl，25 mmol/L 的 MgCl溶液 21.5 μl，25 mmol/L的 dNTPs 0.2 μl，10 μmol/L 的特異性擴(kuò)增上、下游引物對(duì) 0.5～1.0 μl，10 μmol/L 的 Taqman MGB 探針0.5～0.9 μl，10 μmol/L 的 β-actin 上、下游擴(kuò)增引物0.4 μl，10 μmol/L 的 β-actin Taqman 探針 0.4 μl，滅菌水補(bǔ)足至25 μl。PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃15 s，69℃32 s，共 40個(gè)循環(huán)；69℃32 s采集熒光信號(hào)。高鐵血紅蛋白還原法：肝素抗凝血，調(diào)整血漿與紅細(xì)胞比例約1∶1；用移液器吸取50 μl全血加入 50 μl的 MHBR 試劑，混勻，37 ℃4 h；再加入雙蒸水4.9 ml，混勻，2 min后顯色觀察結(jié)果：呈鮮紅色者為正常；呈棕色、棕紅色或紫色為缺乏。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察所有患者檢測(cè)結(jié)果，比較兩組診斷價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0展開分析，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05代表組間數(shù)據(jù)無顯著差異。

2 結(jié)果

熒光定量PCR法檢測(cè)及高鐵血紅蛋白還原法檢測(cè)的診斷準(zhǔn)確率分別為99.22%、85.94%，P＜0.05。見表1。

表1 對(duì)比兩組診斷準(zhǔn)確度[例（%）]

3 討論

蠶豆病患者臨床表現(xiàn)變化不一，有些患者無任何癥狀，而有些則發(fā)生新生兒黃疸、急性溶血等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)新生兒期重癥核黃疸，造成死亡或永久性神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。因此早期診斷顯得尤為重要[3]。

蠶豆病有很多種檢測(cè)方法，高鐵血紅蛋白還原法就是其中之一，但該方法受主觀因素影響大，酶法對(duì)雜合子的檢出率不理想，結(jié)果為弱陽性時(shí)，容易出現(xiàn)主觀誤判，會(huì)出現(xiàn)模棱兩可的情況，臨床診斷效果不佳[4～5]。厲勇等[6]研究表示，可對(duì)蠶豆病采用熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)診斷，其診斷準(zhǔn)確率可達(dá)99.00%。本研究結(jié)果表明，熒光定量PCR法檢測(cè)準(zhǔn)確率比高鐵血紅蛋白還原法檢測(cè)高（P＜0.05）。熒光PCR檢測(cè)方法具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）結(jié)果能確定患者基因型，便于患者進(jìn)行產(chǎn)前診斷；（2）檢測(cè)耗時(shí)短，1 h內(nèi)即可完成；（3）結(jié)果清晰直觀，易于判斷和分析；（4）熒光PCR法中檢測(cè)的6個(gè)突變位點(diǎn)能涵蓋大部分蠶豆病基因。本研究存在的不足與局限性：（1）樣本選取存在一定局限性，主要以2017年的患者為初始樣本，雖然按相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了篩選，但所選取的標(biāo)本是否合理有待商榷；（2）樣本選取例數(shù)較少，臨床可進(jìn)一步擴(kuò)大研究對(duì)象人數(shù)，提升準(zhǔn)確性。

綜上所述，對(duì)蠶豆病患者采用熒光定量PCR法檢測(cè)，其診斷準(zhǔn)確率較高，耗時(shí)短，此方法在臨床上值得進(jìn)一步推廣使用。

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[3]中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)出生缺陷預(yù)防與控制專業(yè)委員會(huì)新生兒篩查學(xué)組,中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會(huì)臨床生化遺傳專業(yè)委員會(huì),中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會(huì)臨床生化遺傳專業(yè)委員會(huì)中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)青春期醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)臨床遺傳學(xué)組,等.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥新生兒篩查、診斷和治療專家共識(shí)[J].中華兒科雜志,2017,55(6):411-414

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[6]厲勇,楊明,菲肖琨.貴陽地區(qū)新生兒G6PD酶篩查結(jié)果分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2014,18(7):1171-1172