中空羥基磷灰石/rhBMP-2人工骨治療骨缺損對(duì)血清堿性磷酸酶的影響

董章慶 涂建龍 熊龍 許振波 周銓昆 蔡敏 吳唯

骨缺損的治療是臨床醫(yī)師研究的熱點(diǎn), 比如如何縮短骨缺損的愈合時(shí)間、減少骨不連的發(fā)生等。本課題組前期成功制備了表面多孔、內(nèi)部中空的羥基磷灰石微球, 并通過壓力滲透的方法將rh BMP-2裝載到中空微球中, 證實(shí)了其在體外具有緩釋行為, 并對(duì)所釋放生長(zhǎng)因子的活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)［1-3］。作者擬建立新西蘭兔骨缺損模型, 觀察植入中空羥基磷灰石/ rhBMP-2人工骨后在骨折愈合過程中對(duì)血清堿性磷酸酶的影響, 為中空羥基磷灰石/rhBMP-2人工骨修復(fù)骨缺損提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取24只成年新西蘭兔制作脛骨缺損模型,雌雄不拘(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心), 體重2.8～3.0 kg。隨機(jī)分為復(fù)合組、單純組與對(duì)照組, 每組8只。新西蘭兔喂養(yǎng)在室溫20℃、相對(duì)濕度50%～70%的環(huán)境中, 自由飲水、進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑 本課題組前期制備了表面多孔、內(nèi)部中空的羥基磷灰石微球, 通過壓力滲透的方法將rh BMP-2裝載到中空微球中, 直徑0.5～0.7 cm, 滅菌處理后備用。堿性磷酸酶體外臨床試劑盒購(gòu)自北京中生生物工程高技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 制備骨缺損動(dòng)物模型 綁定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。用10%水合氯醛溶液按3 ml/kg的劑量行腹腔麻醉。后腿脫毛, 常規(guī)消毒,手術(shù)鋪巾。逐層切開顯露脛骨, 在脛骨前外側(cè)中段鉆孔, 直徑0.8 cm, 復(fù)合組將中空羥基磷灰石/ rhBMP-2人工骨植入缺損處；單純組植入單純中空羥基磷灰石人工骨；對(duì)照組不植入任何材料。創(chuàng)面用生理鹽水沖洗, 逐層縫合后包扎。不作局部?jī)?nèi)、外固定, 傷口不拆線, 讓縫線自行脫落。術(shù)后立即肌內(nèi)注射80萬單位青霉素, 連用3 d。麻醉清醒后常規(guī)喂養(yǎng),自由活動(dòng), 密切觀察兔的飲食、活動(dòng)及傷口反應(yīng)。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察三組手術(shù)效果, 比較三組術(shù)前及術(shù)后4、8、12、16周血清堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果, 分別于術(shù)前,術(shù)后4、8、12、16周每周第1天上午8:00抽取新西蘭兔靜脈血,檢測(cè)其堿性磷酸酶活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用 t檢驗(yàn)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)效果 三組均未發(fā)生全身異常反應(yīng)。傷口無感染,愈合良好, 縫線自行脫落。

2.2 各時(shí)間段血清堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果 術(shù)后4、8周三組堿性磷酸酶較術(shù)前顯著增高, 術(shù)后8周達(dá)最高峰, 之后又逐漸下降。術(shù)前三組血清堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后4、8、12、16 周復(fù)合組血清堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果(109.96±8.98)、(131.37±10.64)、(90.14±6.71)、(60.28±3.76)U/L高于單純組的 (82.47±5.32)、(101.07±4.59)、(65.60±4.59)、(56.03±3.75)U/L, 高于對(duì)照組的 (70.940±4.01)、(87.37±3.31)、(57.42±4.48)、(52.43±2.36)U/L, 且單純組高于對(duì)照組, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 三組各時(shí)間段血清堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果比較( x-±s, U/L)

3 討論

3.1 中空羥基磷灰石可作為理想載體 有研究報(bào)道［4-6］, 無機(jī)材料特別是中空羥基磷灰石具有優(yōu)良的生物相容性、力學(xué)性能、生物活性和骨傳導(dǎo)性, 且能與人體骨組織形成良好的骨性鍵合, 因而被視為一種理想的支架材料, 其中納米羥基磷灰石曾被認(rèn)為是理想的載體［6］, 但其突釋效應(yīng)限制了臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過使用表面多孔且中空的羥基磷灰石微球作為緩釋載體, 裝載rhBMP-2, 構(gòu)建了中空羥基磷灰石/ rhBMP-2 復(fù)合人工骨與不裝載rhBMP-2 的單純中空羥基磷灰石人工骨, 分別植入到兔脛骨缺損處, 結(jié)果證明中空羥基磷灰石是rhBMP-2 較為理想的載體, 具體原因?yàn)棰僦锌樟u基磷灰石最接近天然的骨組織結(jié)構(gòu), 有利于細(xì)胞較好地吸附。②中空羥基磷灰石具有空腔、內(nèi)表面、微孔等多級(jí)吸附結(jié)構(gòu), 可以起到很好的緩釋作用［3］, 發(fā)揮持續(xù)促進(jìn)成骨的效應(yīng)。③中空羥基磷灰石微球在體液環(huán)境中可緩慢降解, 可實(shí)現(xiàn)rhBMP-2的持續(xù)、長(zhǎng)期釋放。

3.2 中空羥基磷灰石/ rhBMP-2 復(fù)合人工骨的優(yōu)勢(shì) ①生物相容性很好, 體內(nèi)可以降解吸收；②釋放周期長(zhǎng), 避免突釋效應(yīng)；③生物力學(xué)性能強(qiáng), 具有優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性能；④可以促進(jìn)骨缺損區(qū)發(fā)生再血管化, 利于骨缺損的修復(fù)［7,10］；⑤來源廣泛, 可以批量生產(chǎn)。因此, 中空羥基磷灰石/ rhBMP-2復(fù)合人工骨材料具有非常大的應(yīng)用前景, 有著極其重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

3.3 堿性磷酸酶活性檢測(cè)的意義 堿性磷酸酶主要由成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌。機(jī)體內(nèi)堿性磷酸酶的活性在rhBMP-2的刺激下會(huì)提高, 這是成骨的一個(gè)比較典型的標(biāo)志, 是反應(yīng)骨及軟骨細(xì)胞的增生程度及活躍程度的良好指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中復(fù)合組和單純組的堿性磷酸酶活性均高于對(duì)照組, 且復(fù)合組高于單純組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 植入后4 周增生活躍, 8 周時(shí)達(dá)最高峰, 說明中空結(jié)構(gòu)有利于成骨, 機(jī)制可能在于中空結(jié)構(gòu)時(shí)成骨面積增大, 其膠原和明膠成分可保持rhBMP-2, 延緩并使其持續(xù)釋放。

綜上所述, 中空羥基磷灰石/ rhBMP-2可提高骨缺損堿性磷酸酶活性, 有效促進(jìn)骨缺損修復(fù)。

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