數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展及其在食品源性成分鑒定中的應(yīng)用

王一村 李娜 翟中華 高靜靜 周莉莉 許士明

摘要：隨著全球食品工業(yè)的蓬勃發(fā)展，食品摻假及造假現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，因此對相關(guān)檢測技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用需求日益迫切。數(shù)字PCR（dPCR）是近年發(fā)展起來的一種對核酸進(jìn)行精確定量的全新方法，不僅能對食品源性成分進(jìn)行精準(zhǔn)定性，更重要的是可對不同來源的摻假成分進(jìn)行定量分析，因此，相對于目前源性成分鑒定中廣泛應(yīng)用的實(shí)時(shí)熒光PCR（qPCR），它的應(yīng)用前景更為廣闊。本文闡述了dPCR的發(fā)展歷程、特點(diǎn)和原理，并對dPCR發(fā)展中遇到的問題進(jìn)行探討。在此基礎(chǔ)上就dPCR技術(shù)在食品源性成分鑒定中的原理和應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并就該技術(shù)在此領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：數(shù)字PCR（dPCR）；食品；源性成分；鑒定；應(yīng)用

中圖分類號：S126文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0160-06

Abstract With the rapid development of food industry in global， the phenomenon of food adulteration and counterfeiting is being more and more serious. Thus， the development and application requirements for related detection technology are urgent. Digital PCR （dPCR） is a new developed precise quantitative method for nucleic counting in recent year. It can not only accurately determine the ingredients of food sources， but also can be used for quantitative analysis of adulterated ingredients from different sources. Therefore， compared with the real-time fluorescence PCR （qPCR）， which is widely used in the source components identification at present， it has a wider application prospect. In this paper，we elaborated the development， characteristics and principles of dPCR， and probed the problems encountered during the developing process. On these bases， the principle and application of dPCR technology in the source component identification were reviewed， and its application prospect in this field was also analysed.

Keywords Digital PCR （dPCR）； Food； Derived ingredient； Identification； Application

近幾年，數(shù)字PCR（dPCR）從產(chǎn)生到應(yīng)用，得到了快速的發(fā)展。該技術(shù)可簡單概括為“微化分析”：一個(gè)樣品被稀釋和分割至最多包含一個(gè)目標(biāo)序列拷貝的百萬甚至數(shù)百萬獨(dú)立反應(yīng)室中，通過計(jì)算“陽性”反應(yīng)（能夠檢測到的序列）與 “陰性”反應(yīng)的數(shù)量，從而確定樣本中DNA分子的絕對拷貝數(shù)。因此，dPCR具有廣泛的應(yīng)用范圍，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等多個(gè)分支，如醫(yī)學(xué)臨床診斷方面的癌癥因子檢測[1-4]、病毒檢測[5-7]、抗藥性分析[8]、致病基因拷貝數(shù)檢測[9-12]以及突變檢測[13-16]等，生物學(xué)研究方面的基因表達(dá)分析[17-20]、基因型鑒定[21-23]、測序分析[24-26]、轉(zhuǎn)基因成分分析[27， 28]以及微生物檢測[29，30]等。

數(shù)字PCR的概念在1992年首次被提出[31]，幾年后，約翰霍普金斯大學(xué)的Bert Vogelstein和Ken Kinzler將之命名為“數(shù)字PCR”，并表明它可以用來量化大腸癌患者糞便中與疾病相關(guān)的基因突變。理論雖然簡單，實(shí)現(xiàn)卻困難重重。最初，實(shí)驗(yàn)在市售的每個(gè)分區(qū)為5 μL的帶有384孔的孔板上進(jìn)行。由于實(shí)驗(yàn)需要大量的試劑，當(dāng)時(shí)許多科學(xué)家對該項(xiàng)技術(shù)的推廣應(yīng)用持有懷疑態(tài)度[32]。

如今，納米加工和微流體技術(shù)取得了很大進(jìn)步，使生產(chǎn)成千上萬納升甚至皮升級別的分區(qū)系統(tǒng)成為可能。目前主流商業(yè)化產(chǎn)品主要應(yīng)用兩種不同方法進(jìn)行分區(qū)， Fluidigm 和Life Technologies 擅長利用芯片在板內(nèi)創(chuàng)建反應(yīng)室，而Bio-Rad 和 RainDance則是將試劑隔離成獨(dú)立的微滴。這使dPCR技術(shù)的應(yīng)用變成了現(xiàn)實(shí)。

在高額利潤和快速金錢回報(bào)的驅(qū)使下，食品摻假問題已成為一種持續(xù)性的社會問題，大量的假冒偽劣食品充斥市場。傳統(tǒng)的源性成分檢測方法主要依靠普通PCR或熒光定量PCR（qPCR），這些方法現(xiàn)階段應(yīng)用雖較為成熟，但仍有缺陷：一是傳統(tǒng)方法步驟較為復(fù)雜[33-36]；二是仍有很多不可消除的因素嚴(yán)重制約著傳統(tǒng)方法在食品源性成分檢測上的準(zhǔn)確性，如PCR擴(kuò)增的效率、非特異目的基因的背景干擾以及內(nèi)參照基因的選取等等[37，38]；三是傳統(tǒng)方法無法進(jìn)行精確定量。dPCR技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用正好可彌補(bǔ)以上缺陷。商業(yè)化dPCR技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用使其在食品安全檢測領(lǐng)域發(fā)揮的作用越來越大。本文對該技術(shù)的發(fā)展歷史和原理進(jìn)行了詳細(xì)闡述，在此基礎(chǔ)上介紹了該技術(shù)在食品源性成分檢測領(lǐng)域的進(jìn)展，旨在為該技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考和新思路。

1 數(shù)字PCR的特點(diǎn)

數(shù)字PCR是核酸絕對定量的新方法，它首先通過分液，將含有目的基因模板的PCR反應(yīng)體系分配到各自獨(dú)立的反應(yīng)器中，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，它具有其他方法尤其是目前應(yīng)用最廣的qPCR不能比擬的優(yōu)點(diǎn)。

（1）靈敏性更高。數(shù)字PCR通過微滴反應(yīng)器將反應(yīng)體系分為20 000個(gè)甚至更多的每個(gè)包含0、1甚至多個(gè)DNA拷貝的微滴。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，陽性和陰性微滴能被精確記錄。最終通過泊松分布法直接計(jì)算出目的基因的DNA絕對數(shù)量。其本質(zhì)是將一個(gè)傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)分解成數(shù)萬個(gè)反應(yīng)，在這數(shù)萬個(gè)反應(yīng)單元中分別獨(dú)立檢測目的序列，從而大大提高了檢測的靈敏度。

（2）耐受性更高。dPCR技術(shù)第一步反應(yīng)體系分配可以使背景序列和PCR反應(yīng)抑制物被均勻分配到每個(gè)反應(yīng)單元，而大部分反應(yīng)單元中并不含有目的序列，低豐度的目的序列被相對富集于某些反應(yīng)單元中，從而顯著地降低了這些反應(yīng)單元中背景序列和抑制物對反應(yīng)的干擾。另外，dPCR在對每個(gè)反應(yīng)單元進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷陽性/陰性兩種狀態(tài)，并不像qPCR依賴于Ct值，因而受擴(kuò)增效率的影響大為降低，對背景序列和抑制物的耐受能力大大提高。

（3）效率更高。分區(qū)越多，dPCR的分辨率越高。對于dPCR來說，如能區(qū)分2和3個(gè)拷貝之間的差異，原則上需要200個(gè)反應(yīng)室；區(qū)分10和11個(gè)拷貝之間差異，則需高達(dá)8 000個(gè)反應(yīng)室。而若要達(dá)到同等精度，qPCR則需相應(yīng)數(shù)量的反應(yīng)次數(shù)，這無疑工作量巨大。由此可見，dPCR的效率和精度遠(yuǎn)高于qPCR。

（4）絕對的計(jì)數(shù)定量能力。dPCR可以進(jìn)行絕對定量，尤其是對于檢測低豐度基因拷貝。而且其結(jié)果直觀，不需要校準(zhǔn)和內(nèi)部控制，數(shù)據(jù)只通過絕對拷貝數(shù)的計(jì)數(shù)便可獲得。利用這種特性，dPCR也可用來進(jìn)行精確定量，并校正其他分辨力和精度相對較低的方法，如qPCR[39] 。

雖然dPCR技術(shù)有其絕對的優(yōu)勢，但相比傳統(tǒng)方法仍存在一定不足：（1）dPCR比傳統(tǒng)方法成本高。昂貴的儀器和相對更貴的試劑一定程度限制了dPCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用。（2）dPCR動態(tài)監(jiān)測范圍沒有傳統(tǒng)PCR方法寬泛。例如，即使一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄量比另一個(gè)基因高出十億倍，qPCR技術(shù)也能夠成功監(jiān)測。但dPCR檢測變化范圍寬的基因拷貝時(shí)，需要稍復(fù)雜的前期工作。（3）dPCR應(yīng)用沒有其他PCR技術(shù)廣泛。如dPCR應(yīng)用剛剛開始起步，而qPCR應(yīng)用已相當(dāng)成熟。目前許多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的qPCR實(shí)驗(yàn)遠(yuǎn)多于dPCR。

2 dPCR類型

2.1 基于芯片的dPCR

Fluidigm在2006年生產(chǎn)的數(shù)字PCR儀，其原理是利用微流控芯片將兩個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行試劑與樣品的混合，然后對反應(yīng)混合物進(jìn)行分區(qū)，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增后，最終讀取每個(gè)分區(qū)的結(jié)果。主要分為構(gòu)造相對簡單、價(jià)格相對便宜的EP1和BioMark HD兩種系統(tǒng)。其特點(diǎn)是兩個(gè)系統(tǒng)都使用了復(fù)雜的微流控芯片，微型閥門將樣品劃分至大約800個(gè)反應(yīng)分區(qū)（每區(qū)有12或48個(gè)樣品）。EP1系統(tǒng)用來監(jiān)測反應(yīng)結(jié)果，即只能監(jiān)測反應(yīng)是否成功，而BioMark HD系統(tǒng)不僅能實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程，還可對假陽性結(jié)果進(jìn)行排除，且該系統(tǒng)也可用來進(jìn)行qPCR。

Life Technologies是在2009年生產(chǎn)的數(shù)字PCR儀，原理是通過毛細(xì)管力及樣品表面的疏水作用力在具有納米級反應(yīng)孔的反應(yīng)板上將樣品分液。主要產(chǎn)品型號為OpenArray 和 QuantStudio 12K Flex，這兩款的特點(diǎn)是既具有dPCR功能，也可同時(shí)進(jìn)行qPCR。OpenArray機(jī)器擁有最多三片平板，每個(gè)平板包含48個(gè)陣列，每個(gè)陣列包含64個(gè)分區(qū)。QuantStudio擁有最多四片平板，也可以兼容TaqMan探針的高通量qPCR。

2.2 基于微滴的dPCR

QuantaLife公司是第一個(gè)將微滴PCR系統(tǒng)進(jìn)行商業(yè)化的公司?，F(xiàn)階段最前沿的為QX200系統(tǒng)，設(shè)備由微滴生成儀和微滴分析儀兩部分組成。生成儀將PCR反應(yīng)液生成微滴，經(jīng)PCR熱循環(huán)儀擴(kuò)增后，分析儀分析每個(gè)液滴的成分。微滴被吸入后，經(jīng)管路分解乳化，依次通過雙色光學(xué)檢測系統(tǒng)進(jìn)行分析，每次最多可處理96個(gè)樣品。該系統(tǒng)具有分辨力強(qiáng)和靈敏度高的明顯優(yōu)勢，F(xiàn)loren等的研究表明，應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，檢測限和定性檢測限分別可達(dá)到質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.01%和0.001%[40] 。此外，該系統(tǒng)還可進(jìn)行測序或克隆分析。

Raindrop plus dPCR系統(tǒng)由RainDance開發(fā)。其原理和工作流程與Bio-Rad的QX200類似。該系統(tǒng)的原理是用RainStorm皮滴液專利技術(shù)將反應(yīng)液均分為千萬個(gè)微滴。該系統(tǒng)也具有較強(qiáng)的分辨力和較高的靈敏度，檢出限可達(dá)0.0001%[41，42] 。

Bio-Rad和 RainDance公司的微滴dPCR（ddPCR）體系反應(yīng)原理和特點(diǎn)一致，在儀器中反應(yīng)室不是由物理的隔膜來分隔，而是由油、水和化學(xué)穩(wěn)定劑組成的精細(xì)乳液分隔。首先，樣品通過儀器與試劑混合，并分散成微小的液滴；然后，每個(gè)樣品微滴被轉(zhuǎn)移至PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；最后，反應(yīng)管被轉(zhuǎn)移至微滴計(jì)數(shù)器中進(jìn)行讀數(shù)，從而分析每一個(gè)液滴是否發(fā)生了反應(yīng)。2017年1月17日，Bio-Rad宣布收購其dPCR的競爭對手——RainDance，且已在2017年第一季度完成。這進(jìn)一步鞏固了Bio-Rad在dPCR領(lǐng)域的領(lǐng)先地位，我們期待著dPCR為生命科學(xué)和臨床診斷客戶提供更為多樣化的核酸檢測應(yīng)用解決方案。

3 數(shù)字PCR在食品源性成分鑒定上的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 數(shù)字PCR在食品源性成分鑒定上的優(yōu)勢

dPCR是一種對核酸進(jìn)行精確定量的全新方法[43， 44]，它利用有限稀釋及泊松分布分析對目的DNA的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量[45] 。因此，對于食品源性成分鑒定來說，dPCR在定性和定量檢測方面都具有明顯的優(yōu)勢。

一方面，食品種類和各類添加物繁雜，傳統(tǒng)方法受復(fù)雜基質(zhì)影響較大，而dPCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和對照，不受PCR抑制物及PCR效率的影響，而是通過單分子計(jì)數(shù)方式實(shí)現(xiàn)基因拷貝數(shù)絕對定量，結(jié)果更為準(zhǔn)確，更適合用于食品源性成分定量分析[46] 。作為qPCR的升級版，dPCR具有更精確、更靈敏的DNA拷貝數(shù)測量結(jié)果。另一方面，dPCR的靈敏度明顯優(yōu)于食品源性成分傳統(tǒng)鑒別方法，這在鑒別食品中摻入的微量成分時(shí)意義重大。此外，dPCR的分液技術(shù)使其擁有更高效的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)篩選多種成分，總體看來這大大節(jié)省了食品源性成分檢測領(lǐng)域內(nèi)的成本。

3.2 dPCR在食品源性成分鑒定上的應(yīng)用現(xiàn)狀

將dPCR技術(shù)應(yīng)用于食品源性成分檢測，并對各組分進(jìn)行定量分析是近幾年研究的熱點(diǎn)。Cai等采用dPCR方法建立了一種新的肉源性定量方法，利用該方法能夠在肉制品的質(zhì)量、DNA含量及特定目標(biāo)基因的拷貝數(shù)之間建立良好的線性關(guān)系，進(jìn)而檢測肉類樣品中豬肉和雞肉的準(zhǔn)確重量及百分含量，并利用上述方法對超市中買到的11種不同的肉制品中雞肉和豬肉的比例進(jìn)行實(shí)測，結(jié)果表明這種新方法能精確判定豬肉和雞肉的百分含量，從而具有較大的應(yīng)用前景[46] 。苗麗等為準(zhǔn)確定量肉及肉制品中羊源性成分的含量，建立了dPCR定量檢測系統(tǒng)，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)羊肉質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系。通過這種線性關(guān)系對各類肉含量進(jìn)行定量，結(jié)果偏差小，最大僅為1.52%[47] 。利用同樣的方法，苗麗等還建立了定量檢測肉及肉制品中牛肉和豬肉含量的方法，結(jié)果也能夠準(zhǔn)確檢出不同樣品中牛肉和豬肉的含量[48] 。

王珊等建立了一種定量檢測羊肉制品中羊源性和豬源性成分的微滴式dPCR方法，結(jié)果表明dPCR方法能夠?qū)NA模板進(jìn)行定量分析。通過對dPCR和qPCR方法的比較，結(jié)論表明在肉種成分真?zhèn)舞b定上，dPCR方法更為科學(xué)和準(zhǔn)確[49] 。Floren等通過將dPCR與qPCR相結(jié)合，建立了肉及肉制品中牛、馬和豬源成分的定量檢測方法，通過方法比較，證明dPCR明顯優(yōu)于qPCR。而dPCR在檢測羊、馬、豬源性成分上的定量限和檢出限可低至0.01%和0.001%[40] 。Ren等利用相似的原理，用dPCR對雞、豬、山羊和綿羊肉源性進(jìn)行精確定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性良好[50] 。綜合來看，dPCR無論在精確性、靈敏度以及穩(wěn)定性上都優(yōu)于qPCR，且肉的不同部位來源并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[50，51] 。

除利用dPCR進(jìn)行精確定性和定量分析外，一種多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法近期被用于源性成分檢測。楊碩等利用多重dPCR定量檢測技術(shù)快速檢測食品原材料及加工食品中的核桃、大豆、椰子及花生源性成分，取得巨大市場和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[52，53] 。利用相同的原理，楊華等對加工食品中摻入的雞、鴨和豬成分進(jìn)行了多重dPCR的快速篩選方法研究[54] 。dPCR能一次性快速檢測多種物種，在食品檢測應(yīng)用上前景廣闊。

4 問題與展望

雖然dPCR不像其他方法需要精細(xì)的校準(zhǔn)和內(nèi)控，但仍需進(jìn)一步深入研究，畢竟在極其微小體積內(nèi)的單分子克隆是個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的工程?，F(xiàn)階段，dPCR仍處于技術(shù)應(yīng)用的早期階段，如要利用dPCR得到精確的數(shù)據(jù)，以下幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)尤其需要注意：（1）實(shí)驗(yàn)的可操控性和重復(fù)性，這對dPCR尤其重要。（2）實(shí)驗(yàn)的特異性。在尋找稀有目的基因時(shí)，了解假陽性率對實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的。在某些情況下，假陽性的數(shù)量會干擾最終的數(shù)據(jù)判斷。（3）實(shí)驗(yàn)的預(yù)估性。在量化諸如拷貝數(shù)變異或基因表達(dá)等高豐度基因分子的應(yīng)用上，通常需要先對目的基因濃度進(jìn)行粗略估計(jì)，以便得到合適的稀釋液。否則，一個(gè)反應(yīng)區(qū)內(nèi)會包含多拷貝，如果每個(gè)分區(qū)都顯示出陽性反應(yīng)，就無法準(zhǔn)確計(jì)算原始分子的濃度，這必然影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。這一點(diǎn)還需要研究人員應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)知識去彌補(bǔ)。除以上三點(diǎn)之外，還要確保有足夠體積的樣品能獲取稀有目的基因片段。

dPCR技術(shù)雖在食品及食品相關(guān)產(chǎn)品檢測上已經(jīng)發(fā)揮了巨大作用，但也存在一定局限性。一方面，儀器昂貴一定程度限制了該技術(shù)的推廣；另一方面，在定量檢測中，仍不能滿足市場中多種類、多樣式的檢測需求，比如對于市場上千奇百怪的未知摻假物質(zhì)以及添加各類復(fù)雜添加劑的食品來說，其作用依然有限。還需要進(jìn)一步的科研支撐來突破這類瓶頸。

總體而言，dPCR的應(yīng)用潛力無疑是巨大的。隨著技術(shù)的成熟和成本的下降，相信越來越多的研究者會利用dPCR去解決現(xiàn)階段無法解決的科研難題，dPCR技術(shù)也將發(fā)揮越來越重要的作用。

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