卡比多巴抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖及其作用機制

秦 舒，朱玉蓉

流行病學(xué)研究表明，帕金森?。≒D）患者需長期服用左旋多巴和卡比多巴，其多種惡性腫瘤的發(fā)病率顯著低于正常健康人群，包括胃癌、肝癌、胰腺癌、直腸癌、前列腺癌、肺癌等，但黑色素瘤和乳腺癌除外[1]。由此推測，左旋多巴和卡比多巴是否可能具有抗癌作用。因此，針對左旋多巴進(jìn)行了大量的研究，但實驗結(jié)果并未證實左旋多巴具有抑制多種惡性腫瘤的作用[2]。但研究發(fā)現(xiàn)，卡比多巴的化學(xué)結(jié)構(gòu)與苯肼十分相似。苯肼是吲哚胺-2,3-雙加氧酶1（IDO1）的一種抑制劑，而IDO1則是細(xì)胞內(nèi)色氨酸降解代謝的主要催化酶，其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸又是芳香烴受體(AhR)的生理激活劑[3]。與此同時，大量相關(guān)實驗表明，AhR參與細(xì)胞增殖、凋亡及免疫代謝[4-6]，直接影響腫瘤的黏附、生長、遷移和侵襲。因此，不難提出假設(shè)，卡比多巴是否是通過影響AhR的活性來發(fā)揮抗癌作用。我國是乙肝大國，每年約有22萬人死于原發(fā)性肝癌，其死亡率在惡性腫瘤中排名第2[7]。本實驗建立肝癌HepG2細(xì)胞株的離體模型，通過不同濃度卡比多巴的干預(yù)，觀察HepG2細(xì)胞的增殖能力、AhR的激活以及CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1等靶基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，借此驗證卡比多巴是否具有抗癌作用，并探索其可能的藥理機制，以期為肝癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞及儀器、試劑 人肝癌HepG2細(xì)胞株，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；胎牛血清（德國Biochrom公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；卡比多巴、MTT、DMSO（美國 Sigma公司）；自動酶標(biāo)儀（美國 BIO-RAD 550型）；高容量cDNA合成試劑盒(美國Invitrogen公司)；引物序列（中國華大基因）；Alexa Fluor 488、DAPI(美國 Molecular Probes公司)；Ⅰ、Ⅱ抗（美國 Abcam 公司）；熒光顯微鏡（瑞士MMI公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞株在37℃條件下，使用DMEM高糖培養(yǎng)基（10%的胎牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素 100 g/L），在 5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，并傳代10～20代。所有實驗均采用處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，并重復(fù)3次。

1.3 MTT法測定細(xì)胞生存率 取HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×104個細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后按實驗要求分別加入終濃度為0、1、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μM 的卡比多巴。 以上各組每天棄上清，并更換一次卡比多巴，2 w后終止培養(yǎng)。向每個孔中加入MTT(20 μl，5 g/L)和DMEM培養(yǎng)液（180 μl， 無血清）； 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后， 加入 150 μl DMSO，37℃下溶解10 min。然后放入自動酶標(biāo)儀，測定吸光度值（A570nm），并按照下面的公式計算細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率=（實驗組A570nm值）/（對照組A570nm值）×100%。

1.4 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）測定細(xì)胞中CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA的表達(dá) 取HepG2細(xì)胞，將其制成單細(xì)胞懸液，以每孔1.8×105個細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞貼壁生長良好后，分別加入卡比多巴（0、10、50 μM）、CH223191（0、10 μM），作用6 h，提取各組細(xì)胞的RNA。使用高容量cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃，30 s；變性 95 ℃，5 s；退火、延伸60℃，30 s， 共40個循環(huán)；65～95℃（每次增加0.5℃）測定熔解曲線。擴(kuò)增得到的Ct值使用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 免疫熒光觀察AhR表達(dá) 使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入Ⅰ抗（小鼠抗 AhR 抗體）（1∶50），在4℃條件下孵育45 min；再加入Ⅱ抗（羊抗鼠IgG，綠色）（1∶400）在37 ℃條件下孵育 2 h；接著加入 DAPI染色5 min；然后在熒光顯微鏡下觀察。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LST-t檢驗，假設(shè)檢驗水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度卡比多巴對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用不同濃度的卡比多巴 （1、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μM）對HepG2細(xì)胞增殖均有顯著的抑制作用（P<0.05），且呈現(xiàn)濃度依賴性（圖 1）。

圖1 不同濃度卡比多巴對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用

2.2 不同濃度卡比多巴對 CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1基因表達(dá)的影響 卡比多巴顯著增加了CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA 的含量(P<0.05)，且呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性（圖 2、3）。

圖2 不同濃度卡比多巴對于CYP1A1 mRNA表達(dá)水平的影響

圖3 不同濃度卡比多巴對于CYP1A2和CYP1B1 mRNA表達(dá)水平的影響

2.3 CH223191抑制卡比多巴的阻斷作用 卡比多巴可顯著增加CYP1A1 mRNA的相對水平（P<0.05）；加入 CH223191（AhR 的特異性拮抗劑）后，可有效阻斷卡比多巴對于CYP1A1基因表達(dá)的激活作用（P<0.05，圖 4）。

圖4 CH223191阻斷卡比多巴對于CYP1A1基因表達(dá)的激活作用

2.4 卡比多巴處理導(dǎo)致AhR的激活 免疫組化染色顯示，相比于空白對照組，卡比多巴處理的實驗組細(xì)胞核（藍(lán)色）中出現(xiàn)了AhR（綠色），提示AhR被激活，并發(fā)生核轉(zhuǎn)移（圖5）。

圖5 卡比多巴激活A(yù)hR并發(fā)生核轉(zhuǎn)移（×100）

3 討論

卡比多巴通過抑制外周多巴脫羧酶來防止左旋多巴轉(zhuǎn)化為無法通過血腦屏障的多巴胺[8]，從而喪失藥效。因此，其多與左旋多巴配伍，常用于PD的輔助治療。臨床推薦用量為50～100 mg/d，但即使將其用量提高到450 mg/d，仍具有很高的安全性[9]，證明其毒副作用小。本實驗結(jié)果顯示，較低濃度（1 μM）的卡比多巴即可顯著抑制HepG2細(xì)胞的生長增殖，且呈現(xiàn)濃度依賴性，證實其具有高效的抗癌作用。

受到卡比多巴分子結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，推測其藥理作用的靶點可能是AhR。它是一種配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，通過與不同配體的結(jié)合而激活，后以異二聚體復(fù)合物的形式發(fā)生核轉(zhuǎn)移，通過經(jīng)典/非經(jīng)典多條信號傳導(dǎo)通路激活下游靶基因[10]。研究表明，AhR在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，包括肝癌[11]。AhR活化后改變腫瘤細(xì)胞周期，促進(jìn)其生長增殖，并抑制凋亡[5]；同時降低其的接觸能力，增加轉(zhuǎn)移和侵襲的可能[12]。陳艷美等[13]利用RNA干擾HCCLM3細(xì)胞中的AhR，發(fā)現(xiàn)HCCLM3細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著降低；將RNA干擾的HCCLM3細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，其腫瘤生長也受到了顯著的抑制。本實驗通過免疫組化染色顯示，卡比多巴引起了AhR激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)移；RT-PCR結(jié)果顯示，卡比多巴導(dǎo)致3種目標(biāo)基因 CYP1A1、CYP1A2和 CYP1B1 mRNA水平的增高。同時，添加CH223191可有效阻斷了CYP1A1的轉(zhuǎn)錄，這些均證明卡比多巴是通過激活A(yù)hR來發(fā)揮其抗腫瘤作用，這與文獻(xiàn)描述相矛盾。究其原因，可能是因為AhR具有配體依賴性和雙重調(diào)控性。配體依賴性是指不同類型的配體同樣作用于AhR，但最終可能產(chǎn)生促癌和抑癌兩種截然不同的結(jié)果，如多環(huán)芳烴、鹵代芳烴等配體結(jié)合AhR后，主要發(fā)揮促癌作用；而苯并噻唑、氨基黃酮等配體結(jié)合AhR后，則主要發(fā)揮抑癌作用[14]。雙重調(diào)控性是指同一種配體在兩種不同的環(huán)境中與AhR結(jié)合，但結(jié)果可能分別表現(xiàn)為活化和抑制AhR，如山柰酚在MCF-7細(xì)胞中表現(xiàn)為AhR的激動劑，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；而在含有TCDD的環(huán)境中，山柰酚則表現(xiàn)為AhR的拮抗劑，減少代謝毒物，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[15]?？ū榷喟涂赡芫褪且环N特異性配體，通過與AhR結(jié)合，誘導(dǎo)其構(gòu)象改變，活化并產(chǎn)生抑制肝癌細(xì)胞生長增殖的生物學(xué)效應(yīng)。但具體的作用機制尚不清楚，有待在后續(xù)的實驗中進(jìn)一步深入研究。

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