ARMS法與測序法檢測127例非小細(xì)胞肺癌組織EGFR基因突變的結(jié)果對(duì)比分析

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科 重慶 400000）（2第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院病理科 重慶 400042）

EGFR基因位于第七號(hào)染色體短臂上（7p12），長約118 kb，由28個(gè)外顯子組成。其編碼的蛋白具有酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TK）活性，是NSCLC最常見的驅(qū)動(dòng)基因，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國NSCLC患者中EGFR突變率約為35%～40%[1]。EGFR誘導(dǎo)癌癥至少通過3種機(jī)制：EGFR配體的過表達(dá)、EGFR的擴(kuò)增或EGFR的突變活化，其中以EGFR 的突變活化為主要機(jī)制。已經(jīng)檢測到的突變數(shù)量最多的是非小細(xì)胞肺癌[2-3]。測序法是傳統(tǒng)廣泛應(yīng)用的方法，在檢測EGFR突變中使用較多，但由于其靈敏度有限、檢測過程時(shí)間長，對(duì)技術(shù)設(shè)備條件要求嚴(yán)格等，在臨床應(yīng)用受到一定限制。而ARMS法由于其靈敏度較高、耗時(shí)少、易操作等特點(diǎn)，在各種標(biāo)本類型中甚至在外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA中檢測EGFR突變也有一定的意義。因此本文通過ARMS法和直接測序法兩種檢測的對(duì)比，來選擇更加敏感，準(zhǔn)確的EGFR基因檢測方法。

1.資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

對(duì)2012年7月—2013年11月在第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院病理科接受EGFR突變檢測的NSCLC病人標(biāo)本進(jìn)行研究，其中非小細(xì)胞肺癌的患者127例，其中：男性76例、女性51例、年齡26～83歲，平均年齡54.5歲。

1.2 儀器與試劑

ARMS試劑盒內(nèi)含內(nèi)參基因特異性引物，探針，EGFR基因突變型，內(nèi)控基因特異性引物，dNTP的溶液，TaqDNA聚合酶，陽性質(zhì)控品，PCR管，熒光PCR管。

1.3 檢測步驟

待測樣本進(jìn)行DNA提取后，使用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop1000)測定DNA濃度及純度，取10ulDNA樣本稀釋至100ng∕ul待用。將純化后的DNA用熒光PCR方法進(jìn)行檢測，得到突變基因的反應(yīng)曲線。測序法則上測序儀進(jìn)行檢測，結(jié)果與EGFR序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果成功與否判定

NC1-7管的FAM信號(hào)應(yīng)該無曲線升起，PC應(yīng)有擴(kuò)增（成典型的S型曲線），切Ct值≦28，則可繼續(xù)分析；若內(nèi)參基因（IR）有擴(kuò)增且19≤Ct值≤25，則可繼續(xù)分析；若Ct值較小，則可認(rèn)為DNA樣品濃度過高；若其Ct值較大或無擴(kuò)增，則認(rèn)為DNA樣品濃度過低、發(fā)生降解，或含有PCR抑制劑。若內(nèi)控基因檢測（HEX通道）有擴(kuò)增且Ct≤25，則可繼續(xù)分析；若其Ct值較大或無擴(kuò)增，但突變位點(diǎn)檢測（FAM通道）有擴(kuò)增且Ct值≤38，則可繼續(xù)分析；若其Ct值較大或無擴(kuò)增，而突變位點(diǎn)檢測（FAM通道）無擴(kuò)增或有擴(kuò)增但Ct值＞38，則無法繼續(xù)分析；若樣品中某基因突變位點(diǎn)檢測（FAM通道）有擴(kuò)增且Ct值≤35，則判定該樣本突變結(jié)果陽性；若Ct值＞38或無擴(kuò)增，則判定該突變結(jié)果為陰性；若35＜Ct值≤38，可重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若Ct值仍在此范圍內(nèi)，則判定該樣本突變結(jié)果為疑似陽性（可能由于突變含量低造成Ct值波動(dòng)）。而測序法測出的DNA序列則直接與EGFR基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

由于是兩個(gè)率的比較，且又符合四格表資料的卡方檢驗(yàn)條件（樣本含量）40，理論頻數(shù)不小于5），故采用四格表資料的卡方檢驗(yàn)來比較兩個(gè)率的差別是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.結(jié)果

2.1 在127例兩種檢測的病人中，兩種方法均檢測到突變29例，均無突變者63例，AMRS法檢測出而測序法未測出者31例，反之4例。

表 ARMS法和測序法檢測結(jié)果四格表

根據(jù)上述四格表的分析，通過對(duì)計(jì)數(shù)資料的kappa一致性檢驗(yàn)，得出兩種方法有一定的一致性（k=0.53，P＜0.05）。綜合兩種方法，最終確定有突變的患者為64例，ARMS法檢出60例，敏感性為93.75%，測序法檢出33例，敏感性為51.56%。ARMS法的檢測突變率為47.2%，而直接測序法檢測突變率為26.0%，通過四格表資料卡方檢驗(yàn)對(duì)兩種方法檢出突變率的比較，ARMS法的突變檢出率要明顯高于測序法（P＜0.05）。

2.2 兩種檢測方法結(jié)果

在127例檢測標(biāo)本中，ARMS共檢測到60例突變，突變率為47.2%，有34例21外顯子突變（其中32例L858R突變，2個(gè)L861Q替換）,占所有突變的56.7%，23例19外顯子缺失突變，占所有突變的38.3%，2例18外顯子G719C突變，1例20外顯子插入突變；直接測序法共檢測出33例突變，突變率為26%，其中13例21外顯子點(diǎn)突變，17例19外顯子缺失突變，2例20外顯子插入突變，1例18外顯子點(diǎn)突變。

3.討論

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見的惡性腫瘤，表皮生長因子受體（EGFR）的基因突變狀態(tài)是預(yù)測表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）療效的重要指標(biāo)，所以尋求一個(gè)靈敏，快速，準(zhǔn)確的檢測EGFR基因突變方法是必要的。

測序法是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式，目的是確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)對(duì)突變進(jìn)行定位和鑒定比較研究，是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)。PCR結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)測序峰中是否出現(xiàn)了突變波，其高低影響結(jié)果的判斷。當(dāng)突變的腫瘤細(xì)胞含量少，導(dǎo)致突變峰低或不能測出時(shí)，測序法就可能會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。ARMS法由于只擴(kuò)增突變序列，所以靈敏度會(huì)提高，但由于只能測出包含在試劑盒里的已知突變位點(diǎn)，故假陰性也會(huì)發(fā)生。

測序法需特殊且昂貴設(shè)備，條件要求高，反應(yīng)耗時(shí)長（每檢測一批樣本，前后總耗時(shí)超過3天），且存在著操作繁瑣，對(duì)標(biāo)本所含腫瘤組織的要求比較高，敏感性不低于30%突變拷貝數(shù)。[10]判讀結(jié)果復(fù)雜，對(duì)環(huán)境和操作者有危害等諸多缺點(diǎn)，因而該方法僅適用于少數(shù)技術(shù)裝備精良的實(shí)驗(yàn)室開展，各級(jí)醫(yī)院很少能獨(dú)立開展，使得其運(yùn)用受限。而ARMS法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的一種，具有較高的靈敏度。趙婧雅等[11]的研究表明，對(duì)于活檢小標(biāo)本而言ARMS法較直接測序法擁有更高的突變檢出率；而對(duì)于手術(shù)標(biāo)本無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由檢測結(jié)果得知，最終確定有突變的患者為64例，ARMS法檢出60例，敏感性為93.75%，測序法檢出33例，敏感性為51.56%。ARMS法的檢測突變率為47.2%，而直接測序法檢測突變率為26.0%。通過四格表資料卡方檢驗(yàn)對(duì)兩種方法檢出突變率的比較，ARMS法的突變檢出率要明顯高于測序法（P＜0.05）。

綜上所述，ARMS法比測序法有更高的靈敏度和突變檢出率，而且ARMS法簡單、快速，適合在臨床推廣。

[1]劉標(biāo)，周曉軍.非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化治療的靶向分子檢測[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012,28（8）；831-7.

[2]宿杰阿克蘇，候英勇，等.PCR直接測序法與ARMS檢測非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014,30（3）：331.

[3]王向迎，劉友如，牛艷潔，等.非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變檢測技術(shù)進(jìn)展[J].國際呼吸雜志，2012,32（10）：797.