潤膚霜微生物限度檢查方法研究

程龍 陳霞 熊雯

（成都市食品藥品檢驗研究院 四川 成都 610045）

潤膚霜（人參霜）是以人參皂苷為主要成分，輔以混合醇、單硬脂酸干油酯、液體石蠟、甘油、乳化劑、香精和防腐劑的局部給藥制劑，可益氣活血，促進皮膚代謝，用于治療面部紅斑、丘疹、干燥、脫屑等皮膚炎癥。按照《中國藥典》2015年版四部非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，確定其標(biāo)準(zhǔn)為需氧菌總數(shù)每1g不得過102cfu，霉菌和酵母菌總數(shù)每1g不得過101cfu，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌每1g不得檢出[1]。鑒于本品加入了防腐劑，對微生物的生長可能有一定的抑制作用，故本品在進行微生物限度檢查時，應(yīng)建立適合于本品的方法，消除樣品的抑菌活性，建立可靠有效的方法[2,3,4]。

1.材料

1.1 儀器

超凈工作臺（蘇凈安泰）SW-CJ-2FD；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技）LRH-250；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技）GHP-7290。

1.2 菌種

白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)631001]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]，均來源于中國藥品生物制品檢定所，均為第4代培養(yǎng)物。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、甘露醇氯化鈉瓊脂、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB），均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.4 樣品

潤膚霜（某醫(yī)院生產(chǎn)）

2.方法與結(jié)果

2.1 平皿法驗證需氧菌總數(shù)計數(shù)

2.1.1 菌液制備 按照中國藥典2015年版制備枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌及黑曲霉的菌懸液。

2.1.2 供試液制備 取本品10g，加含5%Tween-80的pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，45℃水浴后用勻漿儀混勻，得1:10供試液。

2.1.3 回收率測定

供試品對照組：

取1:10供試液50mL，取1 mL分別注入2個平皿，共制備兩組，測定供試品本底需氧菌以及霉菌和酵母菌總數(shù)；

菌液對照組：

分別取上述5種試驗菌懸液0.5mL，加至50mL pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，取1mL注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注TSA培養(yǎng)基，測定所加的試驗菌數(shù)。

試驗組：

分別取上述5種菌懸液0.5 mL，加至50ml的1:10供試液中，混勻，取1mL注入平皿，每株菌制備2個平皿，傾注TSA培養(yǎng)基。

分別取上述2種真菌懸液0.5mL，加至50ml的1:10供試液中，混勻，取1mL注入平皿，每株菌制備2個平皿，傾注SDA培養(yǎng)基。

如表1所示。

表1 常規(guī)法驗證需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)試驗結(jié)果（cfu/皿）

2.1.4 結(jié)果 從表1可以看出，取本品1:10供試液按平皿法進行計數(shù)時，TSA培養(yǎng)基中五種試驗菌的回收率均在50%和200%之間，SDA培養(yǎng)基中兩種真菌的回收率也在50%和200%之間。

2.2 控制菌檢查方法的驗證

2.2.1 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢查

試驗組：

取1:10供試液10ml及金黃色葡萄球菌懸液1ml加入到100ml的TSB中，35℃培養(yǎng)24小時。劃線接種于甘露醇氯化鈉平板上，培養(yǎng)后觀察是否有菌生長。

取1:10供試液10ml及銅綠假單胞菌懸液1ml加入到100ml的TSB中，35℃培養(yǎng)24小時。劃線接種于溴化十六烷基三甲銨平板上，培養(yǎng)后觀察是否有菌生長。

陽性對照組：

取制備好的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌懸液1ml加入到100ml的TSB中，后續(xù)操作同上。

陰性對照組：

取10ml pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入到100ml的TSB中，后續(xù)操作同上。

供試品對照組：

取1:10供試液10ml加入到100ml的TSB中，后續(xù)操作同上。

表2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗證結(jié)果

表3 銅綠假單胞菌檢查方法驗證結(jié)果

2.3.2 結(jié)果 由表2和3可知，陰性對照組和供試品對照組均未檢出控制菌，陽性對照組和試驗組均檢出相應(yīng)的控制菌，因此，本品金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢查可用常規(guī)法（TSB：100mL）。

3.討論

本品在制備供試液的時溶解性較差，加入5%的吐溫-80再水浴后，樣品能較好溶解在其中，但本品為較粘稠的霜類，故需進一步用勻漿儀混勻，這樣才能獲得均質(zhì)的供試液[5,6]。另外，本品的供試液有一定的粘附性，在用移液管或移液槍吸打供試液時，應(yīng)緩慢操作，等待一段時間盡量使掛壁的供試液緩慢流下，以保證取樣的準(zhǔn)確性。

本品對細菌及真菌的抑制作用較小，微生物計數(shù)及控制菌檢查均可采用常規(guī)法。根據(jù)驗證結(jié)果將微生物限度檢查方法記錄如下：取本品10g，加含5%Tween-80的pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，45℃水浴后用勻漿儀混勻，得1:10供試液。需氧菌總數(shù)以及霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)可取1:10供試液按平皿法進行，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢查均可采用常規(guī)法（TSB：100mL）。

[1]國家藥典委員會.中國人民共和國藥典[s].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015四部：140.

[2]楊曉莉，李輝，馬英英等.中國藥典2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法解讀[J].藥物分析雜志，2016，36（6）:1101-1107.

[3]楊曉莉，李輝，馬英英，等.中國藥典2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法解讀與對策[J].中國藥師，2016，19（4）:748-752.

[4]程龍，熊雯，陳霞.過敏康膠囊微生物限度檢查的方法建立[J].中藥與臨床，2017，8（3）:38-41.

[5]胡澤鍇，毛騰霄.抗敏止癢霜微生物限度檢查方法研究[J].海峽藥學(xué)，2016，28（11）:70-72.

[6]陳璐，汪洋，涂碎萍.抗痤霜微生物限度檢查方法驗證[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，2016，37（6）:266-269.