大黃酸兔源多克隆抗血清的制備與鑒定

王詠枝 屈會(huì)化 邢洪霞 張?jiān)? 成金俊 熊威 羅娟 趙琰 孔慧 王慶國(guó)

摘要：目的 合成大黃酸人工抗原，制備敏感性高、特異性強(qiáng)的大黃酸兔源多克隆抗血清。方法 采用碳二亞胺法制備大黃酸人工抗原，將大黃酸分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白相偶聯(lián)。用紫外掃描法鑒定大黃酸人工抗原是否偶聯(lián)成功，免疫新西蘭兔，制備多抗血清，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定抗血清的敏感性和特異性，并分別用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和HPLC檢測(cè)大黃中大黃酸的含量。結(jié)果 2只新西蘭兔產(chǎn)生的多抗血清效價(jià)在1∶64 000以上，其中，2號(hào)兔多抗血清敏感性最好，半數(shù)抑制濃度為0.09 ng/mL，且具有良好的特異性。兔抗血清測(cè)得大黃中大黃酸含量為（0.026±0.001）%，HPLC測(cè)得大黃中大黃酸含量為（0.027±0.000）%。結(jié)論 本研究制備了敏感性高、特異性強(qiáng)的大黃酸兔源多克隆抗體血清，為建立大黃酸免疫親和色譜分析技術(shù)和快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大黃酸；人工抗原；碳二亞胺法；兔源多抗血清；酶聯(lián)免疫分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.010

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）05-0041-05

Preparation and Identification of Rhein Rabbit Polyclonal Antiserum

WANG Yong-zhi1， QU Hui-hua2， XING Hong-xia3， ZHANG Yue1， CHENG Jin-jun4，

XIONG Wei1， LUO Juan1， ZHAO Yan4， KONG Hui4， WANG Qing-guo4

1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 3. Qufu Traditional Chinese Medicine Hospital， Qufu 273100， China；

4. School of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

Abstract： Objective To synthesize rhein （RHE） artificial antigens； To prepare high sensitivity and specificity polyclonal antiserum against RHE. Methods RHE was coupled respectively to bovine serum albumin （BSA） and ovalbumin （OVA） by using carbodimide two-step method. The RHE artificial antigen was identified by UV spectrophotometry， then it was injected to rabbits for antiserum preparation. Anti-serum titer was determined by indirect ELISA. Sensitivity and specificity were identified by indirect competitive ELISA. And the contents of RHE of Rhei Radix et Rhizoma were detected by indirect competitive ELISA and HPLC. Results Indirect ELISA showed a high titer above 1∶64 000. The sensibility of No.2 antiserum was better， which IC50 was 0.09 ng/mL and had good specificity. The content of RHE in Rhei Radix et Rhizoma was （0.026±0.001）% detected by rabbit polyclonal antiserum， and the content of RHE was （0.027±0.000）% detected by HPLC. Conclusion In this study， RHE artificial antigens is synthesized successfully. RHE rabbit polyclonal antiserum with high sensitivity and specificity is prepared， and these may provide basis for the immune affinity chromatography analysis technology and immunology fast detection methods.

Keywords： rhein； artificial antigen； carbodiimide two-step method； rabbit polyclonal antiserum； ELISA

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（81430102）

通訊作者：王慶國(guó)，E-mail：wangqg5858@sina.com

大黃酸（rhein，RHE）屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，是大黃、虎杖、何首烏等多種中藥的主要有效成分[1]，也是大黃藥材的質(zhì)控指標(biāo)之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，大黃酸具有抗腫瘤[2]、抗菌[3]、抗炎[4]、降糖調(diào)脂[5]、保肝抗纖維化[6]等多種活性，在治療糖尿病腎病及協(xié)同抗腫瘤方面表現(xiàn)尤其突出[7]。目前大黃酸常用檢測(cè)方法為HPLC[8-9]，此方法依賴高精密儀器，分析成本高；樣品前處理復(fù)雜，要求專業(yè)的分析人員，耗時(shí)長(zhǎng)；不適宜現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大樣本檢測(cè)。而基于小分子多克隆抗體的中藥活性成分免疫學(xué)分析方法（ELISA）靈敏度高，特異性強(qiáng)，前處理簡(jiǎn)單，高通量，且不依賴貴重儀器，操作也較為簡(jiǎn)便[10-11]。RHE免疫分析方法的建立需要得到抗RHE的抗體。本研究對(duì)RHE的人工完全抗原進(jìn)行了合成與鑒定，免疫動(dòng)物新西蘭大白兔獲得了特異性強(qiáng)、靈敏度高的兔源多克隆抗體。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雌性新西蘭大白兔2只，體質(zhì)量2.5 kg，8周齡，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2015-0005。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，溫度15～25 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

RHE，南京澤朗有限公司；大黃飲片，北京仟草有限公司；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher），雙蒸水（娃哈哈）；N-羥基琥珀酸亞胺（NHS），Biotopped；脫脂奶粉，Oxoid公司；卵蛋白（OVA），Sigma公司；水溶性碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），北京化學(xué)試劑廠；牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司；弗式完全佐劑（F5881），Sigma公司；弗式不完全佐劑（F5506），Sigma公司；酶標(biāo)二抗（HRP-標(biāo)記羊抗兔IgG），Gene-Script公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB），Sigma公司；二甲基甲酰胺（DMF），Sigma公司?？烧{(diào)微量系列加樣器，Eppendorf；SZ-93自動(dòng)純水蒸餾器，Labsystems；BS124S電子分析天平，賽多利斯公司；高效液相色譜儀，Agilent Technologies 1260 Infinity；QL-901漩渦混合器，其林貝爾儀器制造有限公司；84-1A磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，Beckman coulter DU 800；10 kD超濾管，Sigma 公司；UV-265FW分光光度計(jì)，日本島津；Millipore 純水系統(tǒng)，Millipore，USA；96孔酶標(biāo)板，Corning；酶標(biāo)儀，Tecan Safire2全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀；TGL-16G臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大黃酸完全抗原的合成方法

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室人工抗原合成方法[12-14]，采用碳二亞胺兩步法，將RHE分別與BSA、OVA偶聯(lián)制備人工抗原與包被抗原。具體方法：準(zhǔn)確稱取BSA 100 mg，溶于2 mL碳酸鹽緩沖液（pH 9.6），為A液；稱取RHE 100 mg，溶于14 mL碳酸鹽緩沖液，另外稱取EDC 76 mg和NHS 38 mg分別溶于1 mL碳酸鹽緩沖液，加入以上配好的RHE溶液中，滴加DMF 2 mL，室溫磁力攪拌2 h，為B液。將A液緩慢滴加到B液中，邊滴邊搖，密封且用錫箔紙包裹避光，室溫?cái)嚢柽B續(xù)反應(yīng)6 h，用10 kD超濾管超濾，碳酸鹽緩沖液清洗3次，獲得RHE-BSA。以相同方法獲得RHE-OVA。

2.2 大黃酸完全抗原的鑒定

2.2.1 紫外掃描法

用PBS精確配制適宜濃度的RHE與BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將待檢樣品按1∶10濃度稀釋，用紫外分光光度計(jì)測(cè)出RHE（a）、BSA（b）、RHE-BSA（c）的全波長(zhǎng)圖譜，計(jì)算RHE-BSA的偶聯(lián)比。同法計(jì)算RHE-OVA的偶聯(lián)比。

2.2.2 動(dòng)物免疫

用RHE-BSA免疫原經(jīng)頸部皮下多點(diǎn)注射免疫2只雌性新西蘭兔。首次免疫予弗氏完全佐劑充分混勻乳化，免疫劑量以RHE計(jì)1 mg/只。以后每間隔2周加強(qiáng)免疫1次，改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，免疫劑量相同。第4次免疫后，耳緣靜脈取血，4 ℃靜置12 h，5000 r/min離心10 min分離血清，分別編號(hào)為1#、2#[14]。

2.2.3 抗體效價(jià)測(cè)定

RHE-OVA作為包被原，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定RHE抗血清的效價(jià)。包被抗原RHE-OVA用CBS按1∶10 000稀釋，加入100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板，每次5 min，共3次。5%脫脂奶粉100 μL/孔封閉，37 ℃封閉1 h，PBST洗板3次。加樣100 μL/孔，抗血清的初始稀釋倍數(shù)為2000倍，以2倍為稀釋梯度逐級(jí)稀釋。以空白血清作為陰性對(duì)照。37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次，再加入100 μL/孔HRP-羊抗兔二抗（1∶10 000），37 ℃反應(yīng)1 h。PBST洗板3次，加入顯色液100 μL/孔，37 ℃顯色15 min，每孔加2 mmol/L硫酸50 μL終止反應(yīng)。測(cè)OD450 nm吸光度。以同一稀釋倍數(shù)抗血清（P）與陰性血清（N）OD450 nm比值（P/N）>2.1時(shí)血清的最大稀釋度為抗體效價(jià)[15]。

2.2.4 抗體敏感性測(cè)定

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)步驟與間接ELISA測(cè)定方法大體相同，不同處在于第1步加入多抗血清50 μL（1∶2000稀釋）和不同濃度RHE溶液50 μL作為競(jìng)爭(zhēng)物，其余操作步驟相同。以RHE質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率A/A0（A0為RHE質(zhì)量濃度為0時(shí)的吸光度，A為RHE不同質(zhì)量濃度的吸光度）為縱坐標(biāo)，繪制多抗血清對(duì)RHE的抑制曲線，根據(jù)曲線回歸方程，計(jì)算多抗血清對(duì)RHE的半數(shù)抑制濃度（IC50），評(píng)價(jià)RHE抗血清的敏感性。

2.2.5 抗體特異性測(cè)定

選擇與RHE具有醌類母核或羧基等類似結(jié)構(gòu)的化合物，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定多抗血清對(duì)不同競(jìng)爭(zhēng)物的IC50值。以多抗血清對(duì)RHE的IC50與多抗血清對(duì)競(jìng)爭(zhēng)物的IC50比值作為交叉反應(yīng)率（CR）[16]，并以CR反映多抗血清的特異性。

2.3 大黃酸含量測(cè)定

2.3.1 HPLC測(cè)定

準(zhǔn)確稱取大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品0.10 mg，用甲醇配制50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL。取大黃飲片粉碎，稱取大黃粉末1.00 g，加30 mL甲醇超聲30 min，過(guò)濾，重復(fù)2次，合并濾液，濃縮，甲醇定容至成10 mL，即為大黃供試品溶液。參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部），選用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇- 0.1%磷酸溶液（85∶15），檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm，進(jìn)樣量10 μL。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，以甲醇配成50、45、35、30、25、20、15、10 μg/mL 8個(gè)濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，供試品用甲醇稀釋10倍，作為待測(cè)樣品，平行測(cè)定3次。

2.3.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定

取上述HPLC大黃供試品溶液100 μL，以PBS稀釋1000倍作為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)的供試品溶液，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，平行測(cè)定3次。

3 結(jié)果

3.1 RHE-BSA偶聯(lián)比

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描結(jié)果可以看出，加入RHE-BSA結(jié)合物的PBS中，RHE吸收峰在437 nm波長(zhǎng)處，BSA的最大吸收為Kmax=277 nm，RHE-BSA結(jié)合物紫外光譜明顯具有RHE和BSA蛋白疊加的特征，并且相同BSA質(zhì)量濃度的結(jié)合物和標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA的紫外光譜相比，在277 nm波長(zhǎng)處吸光度明顯增高。由于偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)透析袋充分透析后，排除未結(jié)合BSA的RHE小分子，而B(niǎo)SA屬于大分子被截留在透析袋內(nèi)，故吸光度增加推測(cè)其原因是RHE與BSA結(jié)合所致。經(jīng)計(jì)算RHE-BSA偶聯(lián)比約為17∶1，在文獻(xiàn)推薦范圍（5∶1～20∶1）[15]內(nèi)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

圖1 RHE-BSA全波長(zhǎng)紫外掃描圖

3.2 抗體效價(jià)

間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2只新西蘭兔均有特異性抗體產(chǎn)生，P/N≥2.1時(shí)，效價(jià)均在1∶64 000以上，見(jiàn)圖2。

圖2 間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)

3.3 敏感性測(cè)定結(jié)果

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定RHE多抗血清抑制效價(jià)的結(jié)果見(jiàn)圖3?？芍?只新西蘭兔所產(chǎn)生的多抗血清均對(duì)RHE有很好的抑制效果，線性回歸方程為Y=-0.205 4X+0.288 6，R2=0.983 8，IC50為0.09 ng/mL，表示2號(hào)兔的多抗血清對(duì)RHE具有很高的敏感性。

圖3 2號(hào)兔多抗血清對(duì)RHE的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA抑制曲線

3.4 抗體特異性測(cè)定結(jié)果

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定兔多抗血清特異性的結(jié)果見(jiàn)表2?？芍撏枚嗫寡鍖?duì)RHE的交叉反應(yīng)率為100%，除蘆薈大黃素的交叉反應(yīng)率是0.1%，其余化合物均小于0.1%，說(shuō)明抗RHE的多抗血清具有良好的特異性。

3.5 大黃酸含量測(cè)定結(jié)果

Ic-ELISA測(cè)得大黃中RHE含量為（0.026±0.001）%。HPLC測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=61.126X-1174.7。測(cè)得大黃中RHE含量為（0.027±0.000）%，采用SPSS20.0對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。因此，Ic-ELISA與HPLC檢測(cè)結(jié)果具有一致性，從而驗(yàn)證了所建立的Ic-ELISA的準(zhǔn)確性。

4 討論

基于抗體特異性的免疫分析方法具有耗時(shí)少、能夠大批量處理樣品、靈敏度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，并且有多種技術(shù)形式，將免疫分析方法應(yīng)用于中醫(yī)藥的研究具有廣闊前景[12，15]。我們通過(guò)合成RHE人工抗原，進(jìn)而產(chǎn)生抗RHE抗體，可以建立起相應(yīng)的免疫分析方法，來(lái)進(jìn)行大黃藥材、含大黃中成藥的質(zhì)量檢測(cè)以及相關(guān)藥物的作用機(jī)理研究等。

人工抗原合成有很多種方法，如碳二亞胺法、高碘酸鈉氧化法及活潑酯法等。不同偶聯(lián)方法所選擇半抗原的連接基團(tuán)或連接部位不同，決定半抗原表位構(gòu)型表達(dá)上的差異，影響半抗原的免疫原性，更決定其免疫抗體的特異性[16]。RHE為1，8-二羥基-3-羧基蒽醌，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)中的1、8位羥基和3位羧基，設(shè)計(jì)RHE人工抗原的合成[17]。為了最大程度保證半抗原的極性與目標(biāo)待測(cè)物的一致性，需要使間隔臂的介入點(diǎn)遠(yuǎn)離特征性基團(tuán)，故本實(shí)驗(yàn)室選用基于羧基的碳二亞胺法來(lái)合成其人工抗原[18]。本方法中，EDC先和RHE反應(yīng)生成一個(gè)加成中間產(chǎn)物，再與蛋白質(zhì)分子上的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，從而實(shí)現(xiàn)兩者的交聯(lián)。本方法操作簡(jiǎn)便，且保留了RHE的特征性結(jié)構(gòu)，可以提高RHE的免疫原性。

目前，鑒別人工抗原是否成功的方法主要有紫外分光光度法、電泳法、質(zhì)譜法及同位素示蹤法等[19]。本研究采用紫外光譜法對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，經(jīng)過(guò)初步鑒定，RHE與載體蛋白成功偶聯(lián)，并且對(duì)免疫新西蘭兔血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所合成的RHE-BSA可使新西蘭兔體內(nèi)產(chǎn)生抗RHE抗體，效價(jià)達(dá)64 000以上，以兔血清測(cè)得大黃中RHE含量為（0.026±0.001）%，HPLC測(cè)得大黃中RHE含量為（0.027±0.000）%，兔多抗血清建立的免疫分析方法測(cè)定結(jié)果與HPLC測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

本研究采用免疫新西蘭兔方法制備抗RHE免疫血清效價(jià)（64 000）較張波等[20]報(bào)道的Balb/C小鼠抗血清效價(jià)（8000）更高；抗體敏感性IC50為0.09 μg/L，遠(yuǎn)高于小鼠抗血清敏感性185.82 μg/L；另外，1只新西蘭兔可得到約50 mL高性價(jià)比抗RHE免疫血清，而1只Balb/C小鼠僅能產(chǎn)腹水5～10 mL，并且所得腹水效價(jià)遠(yuǎn)低于血清。一般情況下制備基于抗體的免疫親和色譜柱需要使用的抗體量比較大，所以兔源性多克隆抗體特別適合用來(lái)制備免疫親和色譜柱，用于中藥特異性成分的敲除[21]或分離[16]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉凱，鄭海生，李應(yīng)東.大黃酸的藥理作用研究述略[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（9）：1732-1734.

[2] 萬(wàn)宗明，孫文軍，陳虹.大黃酸抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)， 2006，17（8）：611-612.

[3] 陳紅斌，陳鈞.大黃對(duì)痔瘡主要致病菌的體外抑菌作用研究[J].中藥藥理與臨床，2006，22（3/4）：111-113.

[4] 尹家樂(lè)，張愛(ài)香，王毓煒，等.大黃酸精氨酸預(yù)防大鼠實(shí)驗(yàn)性腸粘連抗炎機(jī)制的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（1）：18-21.

[5] 呂鵬，盛宏光.大黃酸對(duì)高脂血癥小鼠肝臟脂肪含量的影響[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，22（1）：55-57.

[6] 萬(wàn)曉強(qiáng)，鄭紫丹，尚軍潔，等.大黃酸對(duì)免疫性肝纖維化大鼠形成的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，38（10）：1204-1206.

[7] 李玉賢，王雅君，馮煥姣.大黃酸防治糖尿病腎病的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥咨訊，2011，3（7）：1-2.

[8] 汪躍峰，鐘文武，陳愛(ài)民，等.HPLC法測(cè)定馬蘭中大黃酸的含量[J].安徽醫(yī)藥，2012，16（8）：1082-1083.

[9] 呂惠子，樸光春，鄭光潔.反相高效液相色譜法測(cè)定朝鮮大黃中大黃酸的含量[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（1）：34-36.

[10] CHUANG J C， VAN EMON J M， JONES R， et al. Development and application of immunoaffinity column chromatography for atrazine in complex sample media[J]. Anal Chim Acta，2007，583（1）：32-39.

[11] 屈會(huì)化，趙琰，王慶國(guó).利用免疫芯片技術(shù)篩查中藥注射劑致敏成分[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（1）：23-25.

[12] 趙琰，屈會(huì)化，王慶國(guó).利用單克隆抗體特異性敲除技術(shù)解析中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的新方法[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（17）：2906-2910.

[13] 屈會(huì)化，趙琰，李翼飛，等.中藥活性小分子人工抗原合成的技術(shù)要點(diǎn)[J].中草藥，2012，43（10）：1880-1885.

[14] 屈會(huì)化，趙琰，王雪茜，等.黃芩苷人工抗原的合成與鑒定[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（9）：606-609.

[15] 屈會(huì)化，趙琰，王慶國(guó).基于中藥活性小分子單克隆抗體的復(fù)方配伍機(jī)理研究新思路[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（10）：1418-1421.

[16] QU H H， WANG Y， SHAN W， et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers[J]. Journal of Chromatography B，2015，985（8）：197–205.

[17] 李麗華，劉文泰，戴軍，等.大黃素-BSA不同表位構(gòu)型的免疫原性和特異性研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011，27（5）：419-422.

[18] 姚嘉贊，沈錦玉，郝貴杰，等.氨基脲人工抗原的合成及其多克隆抗體的制備[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（1）：33-35.

[19] 劉洋，屈會(huì)化，任燕，等.人參皂苷Rg1人工抗原的合成及免疫原性鑒定[J].中草藥，2013，44（13）：1738-1742.

[20] 張波，袁媛，黃璐琦，等.大黃酸人工抗原合成及免疫原性鑒定[J]. 中國(guó)中藥雜志，2015，40（8）：1463-1467.

[21] ZHAO Y， FENG H B， SHAN W C， et al. Development of immunoaffinity chromatography to specifically knockout baicalin from Gegenqinlian Decoction[J]. J Sep Sci，2015，38（15）：2746-2752.

（收稿日期：2017-09-05）

（修回日期：2017-10-07；編輯：華強(qiáng)）